电化学DNA传感器的研制-中山大学化学与化学工程学院-SunYat.doc

电化学DNA传感器的研制 邹小勇，陈汇勇，罗利军，谭学才，蔡沛祥 （中山大学，化学与化学工程学院，广州 510275 ） 指导老师：邹小勇 副教授 摘 要 ： 在固定电压下，将单链 DNA 固定在活化的碳糊电极 （CPE）表面，以K3Fe(CN)6为指示剂，研究单链DNA电极（ss-DNA/CPE）、双链DNA电极（ds-DNA/CPE）的指示剂氧化峰电流变化，并研究了在一定电压下，DNA浓度与杂交时间对指示剂的电化学信号的影响。 关键词 ： DNA, 碳糊电极, 电化学传感器；K3Fe(CN)6 目前，电化学 DNA传感器在DNA 序列分析[1]、细茵及病毒感染类疾病诊断[2]、基因诊断[3]、药物的检测和筛选[4,5]、DNA损伤研究[6]、环境监测[7,8]等方面被广泛应用，在生物医学领域有着非常重要的意义。1992年Maeda等人[9]研究了抗疟药阿的平在 DNA 修饰电极上的电化学检测，证实阿的平与DNA分子发生了强烈的特异性相互作用。1997年Wang[10]等人用氧化阳极法, 将与结核杆菌 (Mycobateria tuberculosis) 基因DR区相对应的DNA探针, 固定在碳糊电极表面，制成电化学DNA传感器。 本文以碳糊电极（CPE）为基底电极，K3Fe(CN)6为杂交指示剂，在一定电压下将单链 DNA 固定在活化的电极表面，研制成电化学传感器。并采用了差分定量法初步探索了该传感器对互补序列DNA的识别和测定。 1 实验部分 1 . 1 试剂与仪器 1 . 1 . 1 试 剂 DNA 固定液：0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液（pH=5.0）×10-3mol/L K 3 Fe(CN)6；石墨粉，液体石蜡为分析纯；其他试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。 1 . 1 . 2 材 料 单链 DNA （ss-DNA）’-ACT-GCT-AGA-GAT-TTT-CCA-CAT-3’； B：5’-ATG-TGG-AAA-ATC-TCT-AGC-AGT-3’。 以上材料均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1 . 1 . 2 仪 器 CHI660A电化学分析站；三电极体系：Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，碳糊电极为工作电极。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 碳糊电极的制作 将6g石墨粉和2.5g液体石蜡混合均匀，在玛瑙研钵中充分研磨，直到得到颗粒细小、均匀的碳糊，之后将其装填到套有石墨棒的玻璃管中制成碳糊电极，电极表面要在称量纸上打磨至光滑平整。每次实验前都要重新装填碳糊，以消除背景影响。 1 . 2 . 2 探针的固定 在0.2 mol/L pH=5.0醋酸盐缓冲液中，用+1.7 V电压预处理电极1 min； 随后于含1×10-7 mol/L探针（ss-DNA：A）的上述醋酸盐缓冲液中，在0.5 V电压下固定探针2 min，使探针固定在活化的电极表面。 1 . 2 . 3 电化学信号检测 将电极浸入含K3Fe(CN)6 指示剂（浓度为2×10-4 mol/L）的0.20 mol/L 醋酸盐缓冲液（pH=5.0）中，用循环伏安法（CV），在-0.4—0.8V范围内，以0.01V/s的速度进行扫描，观察指示剂氧化峰电流的变化。 1 . 2 . 4 杂 交 将电极用0.75 mol/L NaCl, 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液淋洗，然后浸入含0.75 mol/L NaCl、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液的杂交液中（其中含1×10-7 mol/L的目的待测 DNA 分子），在0.5 V电压下，进行杂交（杂交时间10～50 min）K3Fe(CN)6 在 ss-DNA/CPE 和 ds-DNA/CPE 上的伏安信号 首先碳糊电极经活化后其表面形成较多羧基与单链DNA中的氨基结合，将单链DNA固定在碳糊电极上，即相当于在碳糊电极上形成一层DNA膜，隔绝K3Fe(CN)6，使其电信号减弱，而后经DNA杂交，指示剂与电极接触更为困难，电信号进一步减弱，通过比较峰电流的变化来判断电极表面DNA是否杂交以及杂交适度。 图1 指示剂在ss-DNA/CPE及ds-DNA/CPE上的不同氧化峰电流信号 Fig.1 Differene oxidative peak current of indicator on ss-DNA/CPE and ds-DNA/CPE 曲线1、裸电极（CPE）的氧化峰电流信号； 曲线2、吸附单链DNA后（ss-DNA/CPE）的氧化峰电流信号； 曲线3、杂交以后双链DNA（ds-DNA/CPE）的氧化峰电流信号。 扫描范围：-0.4—0.8V；扫描速率：0.01V/s；