分子细胞遗传学实验.doc

分子细胞遗传学实验 实验一 质粒DNA的提取 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验三 显微镜使用与摄影技术 实验四 植物染色体制片与观察 实验五 荧光原位杂交实验（原位杂交） 1．仪器：恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅。 2．材料：含质粒的大肠杆菌，1.5mL 离心管，吸头，吸样器。 3．试剂：质粒小量制备试剂盒(质粒DNA小量提取试剂盒, 天根公司) 常用碱法提取质粒的溶液的参考配方： Solution I 50mmo1／L 葡萄糖 25mmo1／L Tris?HCl(pH8.0) 10 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)pH8.0 Solution II 0.4mo1／LNa0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，使用前等体积混合 Solution III 5mo1／L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL TE缓冲液 10mmo1／L Tris?HCl 1mmo1／L EDTA(pH8.0) RNA酶(RNA酶A) Tris?HCl(pH7．5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min， 缓慢冷却至室温，保存于-20℃。 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） 四、实验步骤 I 质粒扩增 将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 II 质粒的提取（试剂盒操作方法） 1、将3～5ml菌液12,000rmp离心30秒收集沉淀（菌体）。 （如果用1.5ml或2ml离心管则需要反复离心2～3次） 2、倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于250μL悬浮液（溶液P1）中。 上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量与纯度。 3、加入150μL裂解液（溶液P2），轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。 不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂时间不宜超过5min，否则会造成染色体DNA的污染。 4、加入150μL中和液（溶液P3），轻柔地颠倒混匀10次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。 5、向吸附柱（吸附柱放入收集管中），加入500μL的平衡液BL, 12,000rmp离心1m，倒掉收集管中的废液。 6、12,000rmp离心8～10mim，将上清液小心转入到吸附柱（吸附柱放入收集管中），12,000rmp离心30s，倒掉收集管中的废液。 7、 将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μL漂洗液PW（请先检查是否加入无水乙醇），12,000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。 如果纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干。否则将影响以后的酶促反应。 8、重复第7步1次，尽可能将杂质去除。 9、取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，加入50μL TE缓冲液于（或灭菌的ddH2O）纯化树脂上，不能沾在管壁上。室温下放置5min后，13,000rmp离心1min。 10、离心管中收集的液体就是洗脱下来的质粒DNA, 取3～5μL电泳，检测其纯度和目测定量。－20℃保存备用。 若有RNA污染，可加入0.5μLRNaseA(10mg/ml)，37℃保温10～30min。 Ⅲ、质粒的琼脂糖凝胶电泳 取10μL洗脱液（质粒DNA）与3μL溴酚蓝混合，用吸样器加入1% Agarose 作凝胶电泳分析。 实验结果 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的HVG18质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNAl条链断裂，(open ci