分子生物学-6研讨.ppt

用于沉淀核酸的盐溶液 电泳 (electrophoresis) 带电荷物质在电场中移 动的现象叫电泳。 DNA 或 RNA 分子带负电荷，在电场作用下，DNA 或 RNA 分子由负极向正极移动。 DNA 或 RNA 分子量越大，迁移速率越慢，反之，分子量越小，迁移速率快。 不同构象的 DNA 或 RNA 分子，迁移速率不同。 一、核酸电泳原理 用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化 DNA 分子。 用变性琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定 RNA 分子。 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DNA 测序反应中合成的系列单链 DNA 片段 (5-500 bp)。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同构象的单链 DNA 分子。 二、核酸电泳类型 电泳仪 水平电泳装置 迁移方向 样品槽 电泳缓冲液 琼脂糖凝胶 - + 琼脂糖 (agarose) 是 D- 和 L-半乳糖残基通过 ?-(1?3) 和 ?-(1?4) 糖苷键交替构成的线状聚合物，琼脂糖凝胶可形成孔径为 50 nm 到 200 nm 的分子筛。 琼脂糖凝胶的分辨率较低，但分离范围较大。 (一) DNA 琼脂糖凝胶电泳 1. 琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分离效果 琼脂糖凝胶浓度 (%) 线状 DNA 分子的有效分离范围 (kb) 0.5 30 → 1.0 0.7 12 → 0.8 1.0 10 → 0.5 1.2 7 → 0.4 1.5 3 → 0.2 1.5-2.0% 琼脂糖凝胶 细胞凋亡时 DNA ladder 的检测 2. 常用电泳缓冲液 * 核酸的制备 核酸的制备 基因组 DNA 的制备 总 RNA 的制备 质粒 DNA 的制备 核酸的一般理化性质 1. DNA 的酸碱及溶解度性质 DNA 有磷酸和碱基，为两性大分子，但偏于酸性； 可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇。 2. DNA的高分子性质 粘度： DNA RNA；dsDNA ssDNA 沉降行为：溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉； 3. 在室温条件下，DNA 在碱中变性，但不水解，RNA水解。 碱基的共轭双键使核苷、核苷酸及核酸在 260 nm 附近有最大吸收峰。 用紫外分光光度计测定核酸分子 在 260 nm 处的光密度值 (optical density, OD 值) 来定量 DNA 和 RNA。 OD260：单核苷酸 ssDNA dsDNA 核酸的紫外吸收 苯酚及氯仿可使蛋白质变性，用于纯化核酸。 用 Tris-HCl (pH 8.0) 饱和酚去除 DNA 溶液中的蛋白质； 用 Tris-HCl (pH 6.7) 饱和酚去除 RNA 溶液中的蛋白质 酚:氯仿:异戊醇 ＝ 25:24:1 酚:氯仿 ＝ 1:1 核酸的分离与纯化 盐离子可中和核酸分子上的磷酸根； 2.5 倍体积的乙醇或 0.9 - 1 倍体积的异丙醇使核酸沉淀； 在 12000 x g 离心力作用下，促进核酸沉淀。 核酸的浓缩 注：需用 70％ 乙醇洗涤核酸沉淀以除去盐离子。 0.2 5.0 氯化钠 0.8 8.0 氯化锂 2.0-2.5 10.0 醋酸铵 0.3 3.0 醋酸钠 终浓度 (M) 储存液 (M) 盐类 建立基因组文库； 克隆特定的基因； 用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数； 用 PCR 方法检测基因的存在及突变等； 进行 DNA 指纹分析。 从细胞或组织中提取的基因组 DNA 的目的： 一、基因组 DNA 的制备 (1) 细胞裂解 蛋白酶 K 和 SDS 可破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，使基因组 DNA 从破碎的细胞中释放出来。 (2) 蛋白质淬取 用酚/氯仿/异戊醇 (25/24/1) 淬取蛋白质。 (3) 基因组 DNA 沉淀 用 0.1 倍体积的 3 M NaAC 和 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的盐离子。 (4) 将基因组 DNA 溶解在 TE 缓冲液中，使其终浓度为 ~1 mg/ml，置 4?C 保存。 (一) 基因组 DNA 的制备方法 (1) 防止内源性 DNase 裂解缓冲液中的 EDTA使 DNA免遭 DNase 的降解。 (2) 保证得到高分子量的基因组 DNA 在制备基因组 DNA 过程中应减少物理机械作用，防止基因组 DNA 的损伤。 (3) 保证基因组 DNA 不被蛋白质所污染，否则将影响限制性内切酶对 DNA 的酶切作用。 高纯度 DNA 的 OD260/OD 280 值大于 1.7。