扬州大学《动物细胞工程》第一章.ppt

污染图 微生物污染及排除 细胞的交叉污染 化学污染 微生物污染及排除 1 微生物污染 ①细菌污染 细菌污染时，常引起培养液混浊； 污染的培养液在显微镜下可见大量细菌； 常见有白色葡萄球菌、大肠杆菌等； 有时虽培养液清亮，但细胞生长缓慢， 用肉汤或琼脂培养基37℃培养数日，观察肉汤培养 基有无混浊，或琼脂培养基上有无菌落形成，以验证 是否被污染。 ②霉菌污染 霉菌污染易于发现； 用肉眼即可见霉菌生长的菌落，菌落大多为白色 或浅黄色小点，漂浮于培养液表面，有的散在生长； 光镜下可见丝状、瘤状或树枝状菌丝，纵横交错， 穿行于细胞之间。念珠菌或酵母菌形态呈卵圆形， 散在于细胞周边和细胞之间。 ③支原体污染 支原体污染甚为普遍，多数实验证实，支原体污染来源主要为操作者和血清； 支原体无细胞壁，呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器的滤膜； 被支原体污染后培养液不混浊，多数细胞无明显变化，或有微细变化； 实验证实，支原体能抑制细胞生长，降低DNA合成； 各类细胞对支原体的感受性和反应性亦有差异，原代细胞和二倍体细胞对支原体耐受性强；多倍体细胞和无限细胞系对支原体敏感。 ④病毒污染 有内源性和外源性病毒污染。 如B95-8细胞能释放高滴度的EBV病毒，MJ细胞能释放T细胞白血病病毒。外源性病毒污染常见有人病毒EBV、狂犬病毒、疱疹病毒、腺病毒等。 病毒的存在威胁着细胞系的质量，也危及操作人员的身体健康。实验者一定要在二级生物安全区内规范操作。 2 微生物污染的排除 良好的无菌操作是控制微生物污染细胞的基础。污染时，首先找出原因。 ① 细菌污染排除 抗生素对预防和杀灭细菌有一定效果，抗生素联合使用比单独使用效果好； 预防性应用比污染后使用效果好，已发生细菌污染再使用抗生素常难以根除； 多数抗生素对细菌仅有抑制作用，而无杀菌效应； 反复使用抗生素可使微生物对抗生素产生耐受性； 对有价值的细胞被污染后，可试用5-10倍常用剂量的冲击方法，加药作用24-48小时，再换入常规培养液，有时可奏效。 ②支原体污染排除 A．抗生素处理 卡那霉素，可清除培养物中的支原体污染；金霉素对细胞毒素较大，一般不使用；对卡那霉素、四环素有抗性的支原体污染，可换用泰乐菌素处理细胞。 B．特异性抗血清处理 用107-108个被污染支原体的细胞免疫家兔，培养物用含5%抗血清的培养液培养，5天后换液一次，总处理时间为11天，然后换常规培养液培养。 缺点是支原体在抗血清处理过程中有时会产生新抗原突变株，处理前后必须进行支原体种类的鉴别。 少见和难培养的支原体，不易制备抗血清。 C．高热处理 支原体和细胞对热的耐受性不同，将受污染的细胞置41℃作用5-10小时，最长不过18小时； 对温度敏感的细胞株不能采用这种方法。 D.巨噬细胞和抗菌素联合处理 将同种动物腹腔巨噬细胞加入被支原体污染的细胞中(巨噬细胞与污染细胞的比例为100：1)，再加入100ug/ml的洁霉素，逐日检查，直至支原体被巨噬细胞消除。 E．鼠的传代处理 污染的肿瘤细胞株可接种于BALB/C裸鼠的颈背部皮下，每只接种4×106个细胞，接种3-5只，在动物带瘤生长一个月时，取瘤块进行原代培养。 F．血清处理 人和动物的血清中，含有一些天然的抗微生物成分，如补体、溶菌酶等。有人将污染的细胞接种到含10%非灭能血清培养基中，孵育6小时后，去除了包括人-人杂交瘤在内的5种细胞系中污染的支原体，并证实起作用的是补体成分。 细胞的交叉污染 多种细胞培养同时进行时，器材和培养用液混杂所致。这种污染使细胞形态和生物学特性发生变化，某些变化不易察觉。 污染细胞一般具有生长优势(如Hela细胞等)，最终压过其它细胞，使其生长抑制，最终死亡；细胞交叉污染导致细胞种类不纯。 ②细胞培养用液公用时，细胞吸管和细胞用液管要分开，千万不能用细胞吸管直接吸细胞培养液。 防止细胞交叉污染的措施主要有： ①同时进行几种细胞培养时，实验器材，如吸管不能混用； 化学污染 化学污染物质包括残存洗涤剂、细胞残余、解体的微生物等。化学污染是细胞培养失败的重要原因。 细胞直接接触物(如培养皿、培养基等)或间接接触物(如配制培养基的器皿、瓶塞等)一旦被化学物质污染，将导致细胞死亡。 化学污染的措施主要有：细胞实验所使用的全部实验器材都要严格清洗，并正确掌握器材操作要领。 第八节 细胞保存与复苏 由于遗传的不稳定性而产生的基因型的漂变； 衰老； 转化； 由于选择和去分化而导致表型的不稳定； 微生物、细胞系间的交叉污染； 孵育失败； 成本； 细胞的长期保存、运输。 -70℃时，储存细胞可见明显的衰退，每年约5%-10%；