棉花生理指标测定方案.docVIP

一 谷胱甘肽还原酶（GR）活性 一、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 棉花 （二）仪器设备 研钵，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，试管数支。 （三）试剂 （1）0.1M（pH7.5）磷酸缓冲液 (PBS,含1%PVP)；0.2mM EDTA； 1.5mM MgCl2；0.025mM NADPH；0.25mM氧化型谷胱甘肽（GSSG） 二、实验步骤 1、酶液提取 取1g棉花叶片于预冷的研钵中，加1 ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 ml。取5 ml于12000r/min下离心20min，上清液即为GR粗提液。 2、显色反应 取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定管，另2支为对照管。 按下表加入各种溶液：（测定时按表格中各溶液的量加倍，以便于重复测定两次。） 显色反应试剂配制表 试剂名称 用量（ml） 0.1mol/L磷酸缓冲液 (PBS) 1.5mmol/L MgCl2 0.2mmol/L EDTA 0.025mmol/L NADPH 0.25mM氧化型谷胱甘肽（GSSG） 酶液 蒸馏水 总体积 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 2 3 对照2支管不加酶液 混匀后比色，3min内每30s记录一次数据 三、结果计算 GR总活性＝（A0-As）×VT/(A0×0.5×FW×V1) 式中：GR总活性以酶单位每克鲜重表示； A0——为照光对照管的吸光度； As——为样品管的吸光度； VT——为样品液总体积ml;（5 ml） V1——为测定时样品用量ml；(0.2 ml) FW——为样品鲜重g;(1g) 二 H2O2含量测定 二、仪器与用具 分光光度计、离心机、研钵、5ml1支，容量瓶10ml 7个、移液管0.2ml，离心管5ml 8支 三、试剂及其配制 （1）100uM H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57ul,溶于100ml丙酮中，此液稀释100倍。 （2）2M 硫酸 （3）丙酮 （4）浓氨水 （5）5%（W/V）硫酸钛 （6）0.3% H2O2 ：吸取0.5ml 30% H2O2用50mmol/L(PH 7.0)的磷酸缓冲液（PBS）定容至50ml 。 四、方法 1 标准曲线制作 取10ml离心管7支，顺序编号，按表加入试剂 试剂 离心管号 1 2 3 4 5 6 7 H2O2 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4°C预冷丙酮 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5%硫酸钛 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 浓氨水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 3000r/min离心10min,弃去上清液，留沉淀 2mol硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶，蒸馏水冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml，415nm下比色。 2 样品提取和测定 （1）称3g,按材料和提取剂1：1的比例加入4°C下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。 （2）用移液管吸取1ml上清液，按表加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000r/min下离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤5次，直到去除植物色素。 （3）向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，转入10ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗离心管，定容至10ml，415nm下比色。 3 结果计算 每克鲜重植物组织中H2O2含量（umol/g）=C*Vt/FW*V1 式中 C-----标准曲线上查得样品中H2O2浓度（umol） Vt----样品提取液总体积（ml） V1----测定时用样品提取液体积（ml） FW----植物组织鲜重（g） 三 乙醇脱氢酶（ADH）活性测定 二、仪器与用具 分光光度计、离心机、研钵，容量瓶，离心管 三、试剂 （1）100mM HEPES （2）50mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris-Hcl）缓冲液(PH 8.0) （3）15mM 二硫苏糖醇（DTT） （4）20%乙醇 （5）0.867mM 氧化型辅酶1（NAD） 1、酶液提取 称棉花叶片0.1 g，加2mlHEPES溶液，1mlDTT研磨成匀浆，转移到离心管中， 10000 r/min 下离心15min 。上清液即为ADH粗提液。 2、ADH活性测定 在3ml 反应体系中包括：（1）50Mm Tris-Hcl缓冲液 ： 1ml （2）20%乙醇： 0.5ml （3）15mM DTT 0.45ml （4