加减一阴煎对血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响.docVIP

加减一阴煎对血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响 中山大学医学部临床医学系2001级 郑跃 陈惠国 罗杰鸿 摘要 目的：探讨中药制剂加减一阴煎对培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响及其机制。方法：以中药复方水煎液对新西兰大白兔灌胃一周，在无菌条件下取血制备血清药，在培养血管内皮和平滑肌细胞中加入不同剂量的血清药，通过细胞计数研究药血清对它们增殖的影响及其机制。结果：与空白组和纯血清组对比，平滑肌细胞数目减少，内皮细胞数目大幅度增加，并有剂量依赖性。结论：加减一阴煎对血管平滑肌细胞增殖有一定的抑制作用，而对血管内皮细胞有触增殖的作用。 关键词 加减一阴煎 血管平滑肌细胞 血管内皮细胞 血清药 研究表明许多植物中含有植物雌激素，如异黄酮、β－谷甾醇等，它们既有拟雌激素样的作用，同时还具有心血管保护作用，以明代《景岳全书》中名方一阴煎为主方的加减一阴煎主要由生地、熟地、白芍、麦冬、黄精、知母、地骨皮、牛膝和炙甘草组成，滋阴补血，活血逐瘀的功效，用于治疗治疗妇女的月经不调的疾病，现代有人将它用于中药人工周期来治疗卵巢功能早衰继发性闭经[1]，表明加减一阴煎具有恢复卵巢功能的作用，具有拟雌激素样的作用。而加减一阴煎是否具有心血管保护作用还未见报道。因此本实验从从中医养阴补血理论出发，运用生理、生化和分子生物学的方法从细胞水平探讨加减一阴煎抗AS的机制，使之能对绝经期妇女AS防治有所帮助。 材料与方法 一 材料 动物： 健康成年新西兰大白兔(2.0-2.5kg)和SD大鼠(150-250g)均由中山大学医学部动物实验中心提供。小牛主动脉内皮细胞，由广州市奶牛研究所提供。 主要药物和试剂： 加减一阴煎（主要由生地、熟地、白芍、麦冬、黄精、知母、地骨皮、牛膝和炙甘草组成）， 胰蛋白酶，血管紧张素Ⅱ 、PBS溶液、无血清的DMEN和含血清含DMEM培养液、 3. 主要实验仪器: CO2培养箱（德国HERAEUAS）二台，Revco超低温冰箱一台，冷冻离心机（德国EPPENDORF）一台，超净工作台二台，倒置显微镜一台，各种水浴箱，天平，自动煎药煲和普通冰箱 二 方法 (一) 药血清的制备 方剂成分的含量：生地15g、熟地20g、白芍15g、麦冬15g、黄精15g、知母15g、牛膝15g 、丹参15g、川芎15g、地骨皮12g、和炙甘草6g。每剂药加水750ml并煎至250ml。选择健康成年新西兰大白兔，每天用中药复方水煎液定时灌胃二次，每次60ml，持续一周. 最后一次灌胃后2小时，在无菌局麻条件下行兔颈总动脉插管放血，离心取血清，56℃、30min灭活补体，4℃保存备用。对照组灌等量生理盐水，同法制备对照血清。 (二)研究药血清影响VSMC增殖的方法 1.VSMC的培养 利用组织块贴壁法进行VSMC培养.取150-250g大鼠,颈椎脱臼法处死,迅速打开胸腔,无菌条件下取出胸主动脉,放入无菌的PBS平衡液中,清除血块和外周结缔组织,去除内皮,用眼科剪剪成1mm3组织块,均匀分散于培养瓶中,放入37oC二氧化碳培养箱孵育,待组织块贴壁后,加入含20%小牛血清的无酚红的DMEN液中继续培养, 七天后细胞从组织块边沿长出,待细胞张满瓶底后可传代.倒去培养液,用PBS洗涤,加入0.125%的胰蛋白酶于37oC消化细胞,倒置显微镜下观察,待细胞收缩变圆,立即倾倒消化液,加入含10%小牛血清的无酚红的DMEN液终止反应,1:2的比例进行分瓶传代.实验用4-6代细胞. 2. 加入药血清培养和细胞计数 VSMC以4X105个细胞/ml密度0.5ml接种于24孔板,当细胞长至亚融合状态,用无血清DMEM液培养24h;加入不同浓度的药血清及对照血清,1h后加入终浓度为10-7mol/L的血管紧张素Ⅱ,培养18h ,倒去培养液,用PBS洗涤,加入0.125%的胰蛋白酶于37oC消化细胞,倒去胰酶,加入0.5mlPBS,吹打使全部细胞悬浮,用滴管滴入计数板,计数. 每孔细胞数目=每计数板细胞×5000　　　　 3. 实验分组 分为三组：空白组Ⅰ；对照组Ⅱ(每孔加10-50ul的对照血清)；药血清组（分别加：10ul、20ul、30ul、50ul、80ul、100ul、120ul和150ul药血清）。每组设4个复管. (三) 研究药血清影响血管内皮增殖的方法 1.新生小牛主动脉内皮细胞(BAECs)的培养和细胞计数 在无菌条件下取新生小牛胸主动脉,按常规方法分离,培养BAECs,原代BAECs呈铺路石状,Ⅷ因子染色阳性.实验采用传代培养第3-5代的细胞,培养液为含100ml/L小牛血清的无酚红的DMEN,处理前24h换用无血清加入转铁蛋白等补