broαdford法测蛋白浓度.docVIP

一、原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。因此考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。但考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成的复合物是蓝色溶液，使该染料的最大吸收λmax的位置从465变成了595，在595nm处有最大吸收值。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，因此利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 优点：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 注：测定时要在染色后5-20分钟内测