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使用 Agilent Cary Eclipse 荧光分光 光度计进行时间分辨测量 可实现准确测量的多功能仪器 技术概述 作者 前言 Fabian Zieschang 博士、 Katherine MacNamara、 Jeff Comerford 和 Kevin Grant 时间分辨荧光技术是常用于标记和追踪关键生物分子的重要分析技术。荧光标记技术检 测随时间变化的荧光信号响应，因此安全性显著高于放射性标记技术，而且荧光测量固 有的分子选择性和分析灵敏度都很高，利用此优势，我们可以更深入地理解样品的化学 性质和分子环境。 安捷伦科技公司 时间分辨荧光测量的一个重要优势是该技术借助可靠的机制解决了背景荧光（来自细胞 或介质的自体荧光）这个常见问题，这些背景荧光可使这类分析复杂化、干扰常用探针 （例如荧光素和罗丹明）的稳态发射，同时也是高背景信号的主要来源（这会削弱测量效 果）。鉴于该技术提升测量能力的巨大潜能，我们不难理解为何（时间分辨荧光技术中所 用的）镧系元素络合物被广泛用于各种生命科学应用，例如免疫分析、受体-配体结合分 析、蛋白质-蛋白质结合分析、细胞因子分析、粘附细胞分析、酶分析、DNA 杂交分析和 细胞毒性分析。  长寿命发射测量的概念 ? 荧光模式：在照射瞬间记录稳态荧光发射信号 ? 磷光模式：在采集样品发射的光之前，软件将命令分光光度计 时间分辨分析技术测量标记分子与入射光发生相互作用而产生 等待用户定义的一段时间，时间长短通常根据灯的衰减时间来 的短时响应（这与仅记录荧光探针瞬时发射的稳态荧光分析相 定义。该模式用于时间分辨“延迟”荧光测量，此类测量通 反）。Agilent Cary Eclipse 荧光分光光度计的闪烁式氙灯每秒开 关（从完全发光到完全黑暗）80 次，这意味着使用 Cary Eclipse 进行每次测量时，闪烁式氙灯都将以 75 kW 以上的峰值功率发出 常使用基于镧系元素的探针 使用 Cary Eclipse，我们能够轻松测量这些各不相同、但几乎同 步产生的荧光响应，而且测量过程不需要任何用户干预。如下所 短光脉冲来激发荧光标签，而且它的弧尺寸较小，因此可提供极 示，所有测量仅通过几个简单的步骤即可编程到软件中，然后自 亮光束（灯的亮度对于荧光测量而言极为重要，因为来自样品的 动运行。 信号与作用于样品的光量成正比，即照射到样品上的光越多，样 品发射的光就越多）。Cary Eclipse 闪烁式氙灯的高脉冲频率和 短衰减时间使其能够执行持续时间最短约 0.1 ms、最长可达无限 长的时间分辨测量。使用 Cary Eclipse 检测样品的时间响应时， 我们使用两种不同的采集模式。 图 1 显示了荧光激发信号强度随时间衰减的典型曲线，以及荧光 和磷光测量之间相对差异的示意图。 ??? ????? ????? ????? ????? ???? ???? ???? ???? ?? (ms) ???? ????? ?? (ms) 图 1. 荧光（绿线）和磷光（紫线）测量的典型响应曲线。瞬时发射是指稳态荧光。长寿命发射是指磷光（或延迟荧 光）响应。延迟时间是指闪烁式氙灯开始发射脉冲与数据采集开始之间间隔的时间长度（您可轻松优化该参数以 去除任何来自短寿命背景荧光的信号和任何散射作用产生的信号）。门限时间是指检测器采集来自发射物的光的 时间长度（门限时间越长，采集到的光就越多，信号强度也就更大）。总衰减时间是指磷光响应的持续时间。一 般而言，实验设置需确保氙灯闪光和新的测量在总衰减时间结束之后开始。时间依赖性分析的主要特性就是该分 析允许用户通过连续累加测量来提高灵敏度（插图） 2  Agilent Cary Eclipse 适用于时间分辨测量的 关键属性 ? Agilent Cary Eclipse 避免了光降解，并且对任何生物样品而 言都非常安全 Eu3+ 本身的吸光能力非常弱，但与某些有机配体结合之后，可形 成具有极强吸光能力和极高发射性的络合物。特别值得关注的 是，虽然 Eu3+ 络合物的吸光特性主要取决于所连接的有机配体， 但发射却是 Eu3+ 独有的特征。这确保了吸收谱带和发射谱带之间 具有相对较大的差距（约 350 至 600 nm），这一特性能够消除激 ? 闪烁式氙灯的高频率 (80 Hz) 优势使其非常适合用于稳态动力 学和时间分辨实验 发光干扰。下一节将简要介绍获得可测信号的步骤。 ? 通过单次测量即可一并测量同一样品的瞬时发射（纳秒级时间 获得镧系元素络合物的可测荧光响应 范围内的荧光发射）和磷光发射（毫秒级时间范围）信号 ? 用户可直接应用磷光模式，无需价格昂贵的其他附件 在大多数时间分辨发射分析中，分析人员