2012单克隆抗体制备操作方法及注意事项-JEN.docVIP

无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套； 2、进去后用酒精棉球擦洗手； 3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌； 4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可； 5、有关试剂使用后及时用封口膜封住； 6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖； 7、出门后需要用钥匙锁上； 8、整个无菌间两周清洁一次； 免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常用的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较好； 首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡； 间隔两周左右时间（14天） 二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在； 间隔两周左右时间（14天） 三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在； 间隔7-10天左右时间 尾部采血测定抗体效价： 方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量0.1ml。固定小鼠用温水（水温约50度左右）泡大约2分钟，这样能使血管充分舒张。用干棉球擦干静脉穿刺选择尾部中下2/3~1/2处比较好,从下向上扎万一一次扎不进，还可以继续使用此血管。左手食指和中指上下夹注你所选择血管的靠近身体的一边,无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾(建立一个穿刺的平面的作用),拇指压住所选血管的尾尖端,上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜.(否则容易人为建立穿刺的角度,而使右手持穿刺针穿刺过深,导致穿刺失败.)右手持穿刺针,稍微挑起皮肤一点,就可以平着进针,看到回血表明成功,还可以回抽,见到回血后表明穿刺已进入血管,可以给药.穿刺结束后,用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血.良好并彻底的止血对于血管可以起到很好的保护作用,这对于需要天天穿刺给药是非常有用的（一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出血）—1ml），在管子上面注明日期、名称，先在4度中静置数小时，再在液氮液面上悬30—60min，之后放入液氮中冻存； 7、复苏，拉线取出冻存管，用漂悬浮在盛有37度水的烧杯，烧杯置于水浴锅中，待融化后转移到含有新鲜培养基的细胞培养瓶中混匀，进行培养，在次日一定要更新培养基，去除DMSO，以有利于后续的培养； 8、 细胞融合时，将3瓶生长良好的细胞液转移在50ml离心管中，1000rpm 10min，弃上清；加30ml DMEM 离心洗涤一次，加10ml 重悬混匀，血细胞计数板计数备用； 在实际培养中，大概三天后细胞基本可以长满，四天开始出现细胞死亡情况，五天后有半数细胞死亡，六天后大部分死亡。 HAT培养液浓度选择 商品化HAT多为50×，先用不完全培养基溶解后（10ml一管），按比例加到完全培养基中制成HAT培养基；HAT一般含量偏高，做梯度培养瘤细胞实验选择合适的HAT培养液浓度； 用24孔板和SP2/0进行 在各孔中加等体积的培养液，培养细胞，待长成单层细胞后依照下表添加不同量的HAT培养观察死亡情况； 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 选择第一天死亡半数细胞；第二天死亡大部分细胞；第三天全部死亡的浓度； 在实际试验中，不同梯度的HAT均可导致瘤细胞的快速死亡，具体试验可选用2%，亦可选用1%； 饲养细胞制备 在细胞融合前，三天内购买Balb/c或KM小鼠2-3只（个体易较大），在细胞融合当天制备饲养细胞； 器材与试剂：解剖工具、5ml玻璃注射器、96孔板、50ml离心管、血细胞计数板、HAT培养液、75%的酒精、250ml烧杯； 操作方法： 将小鼠摘眼球或拉颈脱臼处死，浸泡在75%酒精中5min，随即放入超净台内，小鼠腹部朝上； 酒精棉球腹部擦拭消毒，用止血钳将腹部皮肤拉开，完全露出腹膜； 镊子小心提起小鼠腹部皮肤，注射5ml DMEM溶液，轻轻按摩腹部1-2分钟； 用注射器吸出腹腔内液体，转于50ml离心管中，1000rpm, 10min，弃上清液； 用5ml HAT培养液重悬沉淀，细胞计数，补加液体至细胞浓度为2*105个/ml； 加在96孔板中，每