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毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性摘要一种用于重组蚓激酶（rPI239）的表达系统在巴斯德毕赤酵母的发展。通过1L高密度发酵肉汤制得0.174g上清蛋白。rPI239体外表现出纤溶活性。在体内rPI239的活性是通过凝血酶原时间，高岭土部分凝血酶时间，凝血酶时间和纤溶活性测定。这项工作显示通过巴斯德毕赤酵母和高密度发酵得到的rPI239重组蛋白在体内和体外都具有相似纤溶活性。关键词 蚓激酶；纤维蛋白溶解；毕赤酵母；发酵；活性传统中医学已经长期使用蚯蚓作为药物，因为它们的抗发热和利尿特性。最近研究表明，在蚯蚓干燥粉末含有纤溶酶组分。研究人员在日本，韩国和中国已经分离和研究蚯蚓中获得的蚓激酶。目前的数据显示，在地龙F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2发现的6种同工酶。1986年，Wu等人，从蚯蚓中分离出的一组蚓激酶组件并且证实他们有激活纤溶酶原的纤溶活性和降解纤维蛋白，而EFE-II证实是纤溶活性蚓激酶的基因。该作者通过用I125标记患有肺血管阻塞症兔子血管中的内栓子并且显示口服药物EFE-II后有明显纤溶活性。同工酶（PDBank1IJ7）通过晶体结构分析MIR（多同晶置换）表明它是一个特效弹性蛋白酶S1反应区，表现广泛的底物活性。最近的研究已经表明蚓激酶是有潜力的溶栓药。1999年，Sun等人，从地龙中单独分离出蚓激酶PI239，在纤维蛋白板上发现明显纤溶活性。它的cDNA文库与F-Ⅲ-1/2和EFE-II有89.5％同源性。该PI239蛋白与那些的的t-PA和u-PA具有相同的活性和底物位点。在2001年， Manabu 和 Nobuyoshi通过蚓激酶FIII-2在巴斯德毕赤酵母首次表达 。随后的研究已经证明许多种类的重组蚓激酶可以在酵母和大肠杆菌中表达。近年来，蚓激酶已经在山羊奶表达。尽管一些报道表明，在制得有效的重组蛋白过程中，资料非常少，，表达条件（特别是高密度发酵条件）也很苛刻，但是在这项研究中，还是完成了一套完整实验过程关于蚓激酶的筛选，表达和在酵母菌中发酵。此外，工程酵母的首次高密度发酵表达蚓激酶也在工程改造酵母高密度发酵中进行，并进行初步研究了高密度发酵中重组蚓激酶表达所需的条件。1．材料和方法1.1试剂该蚓激酶PI239酵母表达质粒，pPICPI239的结构，已如前所述。PFU PCR MasterMix自天根生物技术（北京）有限公司，博来霉素和毕赤酵母KM71（HIS4 ARG4 AOX1:: ARG4）均购自Invitrogen公司（卡尔斯巴德，CA）获得。酵母氮源（YNB）1无氨基酸是由Difco（密歇根州底特律）提供。蛋白胨-Y从波士顿生物化学公司（BBI）收购。溶细胞酶是从Sigma获得。牛纤维蛋白原，纤溶酶原，凝血酶，和人尿激酶是从国家研究所购买药品生物制品检定所。低分子量蛋白标准和羊抗鼠碱性磷酸酶第二抗体购自华美生物工程公司（罗燕，中国）购买。预染蛋白分子重标记是由晶美生物科技有限公司（中国）提供。AOX1启动测序引物，5GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3合成由上海生工生物工程技术服务有限公司。1.2分析方法1.2.1 SDS和Western blot分析发酵中的每个步骤的样品进行如Sambrook等人的Western印迹分析。和根据制造商的指示对使用在巴斯德毕赤酵母系统。 1-40ug蛋白质通过15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离（80V10分钟的浓缩胶，120V为120分钟的分离胶）。凝胶用考马斯亮蓝R-250着色，并转移到硝酸纤维素过滤器中，分别为该过滤器用含5％BSA的PBS温育的小鼠的PI239多克隆抗体（内部制备，1：100稀释）与其特异性结合进行2小时，随后小鼠碱性磷酸酶抗体（1：3000稀释）进行1小时。用NBT/ BCIP显现电泳条带，凝胶扫描。1.2.2纤溶活性的测定纤溶活性使用纤维板法测定。Briefly，一种纤维琼脂糖凝胶，它的制备是通过混合牛的纤维蛋白酶原（6毫克/毫升）到预先加热的2.0％琼脂糖的PBS溶液（pH为7.75）和100U/ ml的凝血酶。将10ul样品施加到固体凝胶并在37°C培养16h，在这之后通过与纤溶活性区域的比较测量吸光度，从而测出纤溶活性。1.2.3高密度表达菌株的筛选高表达菌株筛选通过双层过滤薄膜来筛选的。通过蛋白质印迹法将Briefly转移印迹到0.45um醋酸纤维素膜上。并培养在30℃下培养18小时。然后将硝酸纤维素滤膜抽出并和小鼠抗PI239多克隆抗体杂交，着色与基板NBT / BCIP。染色印迹强均为高工程酵母表达菌株。使用这种方法，164株高表达菌株被筛选出来。每个工程高表达菌株筛选与薄膜试验，以再次克隆获得能高表达纤溶活性的重组蛋白菌株的活动。然后将培养物接种于BMGY