丁基苯酞对大鼠缺血脑组织Bcl-2表达的影响_李其富.ppt

丁基苯酞对大鼠缺血脑组织Bcl-2表达的影响 李其富 容琼文 何 俐 海南医学院附属医院神经内科 四川大学华西医院神经内科 背景 丁基苯酞（NBP）是我国研制的具有自主知识产权的治疗急性缺血脑卒中的一类化学新药； NBP对缺血性卒中具有较佳的治疗保护作用，涉及脑缺血病理的多个环节。 细胞凋亡是脑缺血损伤的重要组成部分，Bcl-2基因是脑缺血神经元凋亡调控基因的重要组成部分； Bcl-2是调节基因家族的基本成员，具有明显的抑制细胞凋亡作用和神经保护作用。 目的 研究大鼠局灶性脑缺血时,给予NBP干预对内源性Bcl-2和Bcl-2 mRNA表达的影响; 探讨NBP在大鼠缺血性脑损伤中的神经保护作用可能的机制，为临床药物应用提供实验依据。 材料和方法 材料 实验动物 健康雄性SD大鼠60只，二级动物，3-4月龄，体重280g-350g，成都中医药大学实验动物中心提供。 试剂及药品 NBP由石药集团恩必普药业公司提供，使用前用植物油稀释10倍配成溶剂。 Bcl-2抗体和原位杂交试剂盒，武汉博士得生物技术有限公司生产。 TTC，DAB显色试剂盒、P试剂盒、4%多聚甲醛及其它试剂和药品由实验室提供。 实验方法（1） 建立大鼠局灶性脑缺血模型（MCAO） 采用稍加改良的Zea-Longa法，将SD大鼠制备为大脑中动脉局灶缺血模型（MCAO），栓塞为永久性。参考Zea-Longa的方法在动物清醒后由协作者盲法评分进行行为学5分制评分。 凡术中动物死亡、出现蛛网膜下腔出血、0分或者4分者，均为模型制作失败，不纳入本实验，再随机补充病例，保证实验动物每组数量不变。 手术操作图示 实验方法 （2） 动物分组 假手术组20只大鼠 （大鼠建立MCAO模型后，采用随机数字表法分组） 模型对照组和NBP组各20只。 动物处理 动物清醒后，假手术组、模型对照组（B、D组）予以食用植物油灌喂3日，每次25mg/kg，早晚各一次，3d后处死 。 NBP组予以NBP灌喂3日，每次25mg/kg，早晚各一次，3d后处死 。 实验路线 实验方法 （4） 神经功能缺损评分：Zea-longa 5分制评分法 梗死体积观察与测量：TTC染色 Bcl-2蛋白表达：采用SP免疫组织化学染色 Bcl-2 mRNA表达：采用原位杂交(POD)法 实验方法 （5） 阳性细胞判定 免疫组化：阳性细胞的胞浆、胞膜、轴突着色呈棕黄色。 原位杂交：阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。 图象采集分析 Olympus显微照相系统采图，每只动物取梗死周围大脑皮质、海马和梗死区保存较好部位，光镜下每个部位分析5个视野。 image pro plus 5.02专业图象分析软件进行分析，采用积分光密度值（IOD）进行统计学分析。 统计学方法 对所得数据用SPSS10.0软件包进行数据分析，组间计量资料比较采用单因素方差分析（ one-way ANOVA ），计数资料采用秩和检验。 检验水准：P0.05为有统计学意义。 结 果 1.神经功能缺损评分（NDS） 2.梗死体积比较 3. Bcl-2蛋白表达 4. Bcl-2 mRNA表达 讨论 1.NBP对神经功能评分及梗死体积的影响 本研究所采用Zea-Longa法建立大鼠MCAO模型，其神经行为学、脑组织病理上接近临床，适于脑缺血性卒中治疗实验研究。 本研究发现，与模型对照组相比，NBP在治疗缺血后神经功能缺损和梗死体积在治疗组均明显改善，与NBP前期研究结果相一致，表明NBP对缺血卒中具有改善神经功能损害的作用。 2.NBP对Bcl-2表达的影响 缺血后Bcl-2上调的表达时限尚无统一认识，本研究发现局灶性缺血72h， Bcl-2蛋白和mRNA水平在梗死灶周围和海马区仍处于较高水平，NBP组Bcl-2的表达更为明显。推测NBP能够上调Bcl-2的表达水平和延长表达时限，其具体机制有待于进一步研究 ； 梗死周围区Bcl-2表达最强，梗死核心区表达较弱推测脑缺血时Bcl-2的表达可能必须具备缺血和细胞轻度损伤两个条件，而一旦神经细胞损伤到DNA崩解的程度，它们的合成也即停止。 2.NBP对Bcl-2表达的影响 Bcl-2通过调节线粒体膜渗透性来抑制细胞的凋亡 ；阻止细胞色素c从线粒体释放到细胞质，抑制caspase-3 的激活，从而抑制细胞凋亡； NBP具有对线粒体的保护和改善功能，NBP上调Bcl-2的具体机制是否与线粒体相关尚需进一步研究； NBP可使Bcl-2表达增加，但Bcl-2抗凋亡的作用与Bax相关，NBP对Bax表达的影响还有待于进一步研究； 不同时间点和不同剂量的NBP对脑缺血后Bcl-2表达的影响。 3. 结论 NBP可以明显改善缺血后大鼠的神经功能评分，减小梗死体积。 与对照组相比，NBP组Bc