细胞工程5.1细胞融合OK研究报告.pptVIP

第五章 细胞融合Cell Fusion 细胞融合的定义 细胞融合的意义 基本原理 融合材料 细胞融合技术 融合细胞的选择 细胞融合技术的进展与展望 5.1 细胞融合定义 一、定义 指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程，又称为体细胞杂交 细胞融合（cell fusion）：植物细胞融合又称体细胞杂交，指将不同来源的原生质体（除去细胞壁的细胞）相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。分为自发细胞融合和诱导细胞融合。 自发细胞融合是在未施加任何诱导条件下所发生的细胞融合现象。体内和体外培养都存在，都是偶尔发生。 诱导细胞融合是在人为条件下发生的细胞融合。人工诱导形成的融合细胞有：同核体和异核体。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon） 来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。 融合指数(fusion index)反映细胞融合的效率。 一种是反映融合实验中多核细胞的出现频率， 一种是反映融合实验中多核细胞的细胞核数的出现频率。 5.2 细胞融合的意义 培养新品种，用于遗传性状改良、克服远缘杂交中的不亲和障碍，广泛组合植物的优良遗传性状。 亲缘关系较远的物种间实现基因转移，创造出自然界所没有的新物种。 创造细胞质杂种，通过细胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组的不同组合，这在育种上有着重大价值。 单克隆抗体的制备，这在生物、农业、医疗、制药等领域得到广泛应用。 1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出马铃薯的块茎。 后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”，据说番茄的产量很高。 用细胞融合方法培育的薯番茄 5.3 基本原理 细胞融合的基本过程（显微镜下） 细胞融合的基本过程： 1、细胞在诱融剂或正弦电场作用下凝聚，彼此靠近 2、两个相邻细胞之间的质膜相互融合，随后两个亲本细 胞质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等质膜成分也在融合后的质膜上重新分布 3、细胞质发生融合 4、细胞核融合，形成单核融合细胞 相邻细胞的质膜彼此紧密靠近，细胞能否融合的前提条件 细胞核的融合是一个非常重要的过程，只有细胞核发生融合细胞才能存活 5.4 融合材料 植物或微生物原生质体的制备（见原生质体的制备） 动物单个细胞的获得 组织的获得：动物 组织块 剪碎 离心 组织的消化：酶 消化 漂洗 离心 营养液 胰蛋白酶：细胞质较少的软组织，胚胎、羊膜、上皮、肝、肾 胶原酶：消化纤维组织、上皮组织、癌组织 5.5 细胞融合技术 病毒诱导细胞融合法 一、诱导细胞融合的病毒种类 疱疹病毒（herpes virus） 牛痘病毒（cowpox virus） 副黏液病毒（如仙台病毒） 仙台病毒：亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。 １９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起； 不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。 病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一个单价血细胞凝集素； 刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾液酸残基，攻击细胞表面。 二、病毒诱导体外培养动物细胞融合的基本过程 使足够数量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起 黏结部位质膜被破坏，形成通道，细胞质流通并融合，病毒也随之进入细胞质 两个细胞合并变圆，形成融合细胞 恢复贴壁培养 选择性培养基中筛选杂交细胞 三、病毒加入的方式 两种亲本细胞均制成单细胞悬液，病毒加入悬液中 一种亲本细胞为贴壁状态，另一种亲本细胞制成单细胞悬液，病毒与细胞悬液先后或共同加入 将两种亲本细胞混合贴壁培养，病毒加到培养液中，多余的病毒在融合后要除掉。 化学方法诱导细胞融合 盐类融合法 PEG 细胞融合法 高pH－高Ca2+法 溶血卵磷脂 盐类融合法 应用最早的诱导原生质体融合方法 常用的盐类融合剂： 硝酸盐类，如NaNO3、 KNO3、 Ca(NO3)2等； 氯化物类，如NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2等； 葡聚糖硫酸盐类，如葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠等。 优点：盐类