结核与耐药结核快速诊断技术.pptx

结核及耐药结核自动化检测技术2014年全球结核发病率2014年中国新发病例：8261552014年中国结核发病率：68/100 000近几年我国结核发病率逐年下降，但仍然属于结核高负担国家来源：WHO 2015年工作报告2014年全球耐药结核发病率WHO估算2014年中国耐药结核发病数新发病例：43000复发病例：8200我国属于耐药结核 高负担国家新发结核病例中的耐药结核比例来源：WHO 2015年工作报告高负担国家的耐药结核发现我国当前耐药结核防控的问题：不充分的耐药病人发现，不充足的耐药病人治疗5.56%纳入治疗全球结核控制不理想的问题出在哪里？结核诊治出现偏差！过多依赖X-光片或其他影像学检查，忽略了以痰标本为基础的微生物诊断过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试，比如血清学检查只参考传统的微生物检测结果因为这些检测的不可靠性，WHO 不得不采取非常规手段，特别提出反对这些测试的建议结核诊断的常见技术传统技术现代技术影像学涂片镜检培养皮肤菌素试验IGRA分子诊断可诊断活动期结核感染无法区分活动期结核与潜伏期结核当前临床诊治的难点依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性敏感性为~50%结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%）以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响2个月才获得药敏结果，导致患者脱落2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播无法更早确诊耐药结核患者结核诊断新技术IGRAT-SpotQuantiFeronNAAT技术等温扩增检测技术线性探针基因芯片熔解曲线巢式PCR血清学检测IGRA原理：机体感染过结核分枝杆菌，T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子IFN-γ两者均有大量手工操作步骤，操作要求高QFT低采血量，更具优势T-SPOT.TBQuantiFERON-TB采血量：2岁儿童：2-3ml免疫力低下患者：6-8ml其他患者：4-6ml采血量：0.8-1.2ml操作步骤：反转10次混匀37°C条件下孵育16-24小时2000-3000g离心15分钟用移液管取血浆每个孔内放50ul结合液加入50ul血浆，室温孵育120分钟洗板至少6次每个孔内加100ul底物，室温孵育30分钟加入50ul反应终止液450nm波长下读取吸光度使用专用软件计算结果操作步骤：密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs）洗涤PBMCs将PBMCs与特异抗原一同加入到预包被抗γ-干扰素抗体的培养孔37°C孵育16-20小时洗涤培养孔加标记二抗孵育1小时洗涤培养孔加显色液用蒸馏水终止反应用肉眼判断结果IGRA欧美发达国家或/和结核低负担国家将IGRA写入国家诊疗指南的有：美国、加拿大 、英国、法国、西班牙、德国、意大利、瑞士、荷兰、丹麦、挪威、芬兰、爱尔兰、葡萄牙、捷克共和国、斯洛伐克、波兰、保加利 亚、克罗地亚、澳大利亚、沙特阿拉伯、韩国、日本WHO的推荐2011年，IGRA在中低收入国家的政策声明IGRA适用于高收入、结核低负担国家的潜伏结核筛查在中低收入国家，尤其是结核高负担国家，不推荐使用IGRA环介导等温扩增设备要求较低操作复杂，人工判读结果环介导等温扩增中国CDC推荐可用于基层实验室无耐药检测WHO推荐对于持续有肺结核症状的成人可替代涂片（条件性推荐）可作为持续有肺结核症状的成人的，可作为涂片的后续检测（条件性推荐）备注适用于可开展传统涂片的实验室不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术，尤其是耐药结核高危人群由于缺乏证据，TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值，是否优于涂片尚不清楚TB-Lamp 的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本TB-Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据，仅是推测恒温扩增 — 试纸条法操作步骤：将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增模板液取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置中扩增使用水浴锅或金属浴；63℃扩增1小时；将完成扩增的PCR管放入一次性防污染扩增物试纸条检测装置中检测, 15分钟目测定性结果无需昂贵的仪器无耐药检测手工操作相对较少WHO未评估或推荐恒温扩增 — 试纸条法WHO在2015工作报告新技术章节中提到该技术但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据实时荧光RNA恒温扩增检测技术RNA检测技术，高灵敏度，可区分活菌和死菌，适用于疗效监测需配备超声波仪，且仍需要实时荧光PCR仪检测无耐药检测WHO未评估或推荐手工操作步骤相对较少线性探针结果需要人工判读，或配备专门的设备WHO 2008年推荐用于涂阳标本检测MDR，2013年更新推荐检测二线药物全程检测需6-8小时配套设备繁多，需3个房间，需PCR仪、杂交仪等手工操作步骤繁多，复杂的结果判读基因芯片基于rpoB/kat