基因功能分析的基本策略（参考）.ppt

基因沉默的机制是多方面的 dsRNA 造成的 mRNA 降解。 Post-translational gene silencing dsRNA 造成同源性基因的甲基化和表达关闭。 dsRNA 造成染色质结构变化。 dsRNA 对蛋白质的合成产生影响。 RNAi 和基因敲除 在基因组 DNA 上，通过同源重组进行的基因敲除。 在 mRNA 水平进行的基因敲除： Antisense oligonucleotides Ribozyme RNA interference：dsRNA；siRNA；shRNA dsRNA 能够诱发细胞的抗病毒反应 在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。 dsRNA 激活 dsRNA-dependent protein kinase(PKR)，进一步诱导非序列依赖的内源性 RNA 降解。 在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未形成。通过 dsRNA 可以诱导序列特异的 RNAi。 siRNA 与 shRNA 30bp siRNA 可以诱导 RNAi，并克服哺乳细胞的障碍。 Short hairpin RNA： 　(shRNA) 可达成稳定的基因敲除。 shRNA 表达载体系统 miRNA 表达载体系统 siRNA 设计原则 siRNA antisense 链 5’ 端稳定性较低时具有更好的效率。 必要时采用专业软件进行设计。 采用多个 siRNA 片段，并筛选其中最有效的。 有时 siRNA 的干扰效果只表现在蛋白水平。 尽可能使用较低的 siRNA 浓度，以保证其特异性。 设立补救试验可进一步确认 RNAi 与效果之间的关系。 shRNA 与 siRNA 应用的局限 在某些细胞的特定状态下，shRNA 或 siRNA 仍能够诱发细胞的抗病毒反应。 miRNA 在与其靶基因 mRNA 不完全匹配的情况下仍能够诱发 RNAi。 在有 14bp 匹配的情况下就能够诱发干扰。 siRNA 可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够造成大量蛋白翻译的降低。 shRNA 与 siRNA 的比较 siRNA 应用非常方便，干扰效力往往比较高。 只能进行达成瞬时的基因表达抑制。 　在线虫和植物，siRNA 可扩增，但哺乳细胞不能。 shRNA 前期工作比较复杂。 可以进行稳定的基因表达抑制。 * 逆转录病毒感染法的特点 通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。 4）精子载体法 外源 DNA 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物 共育法 脂质体转染法 电穿孔法 DNA 精子 受精卵 DNA 卵细胞 DNA 胚胎干细胞 DNA 逆转录病毒感染 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 微注射 显微注射 3. 下游—基因整合与表达检测及筛选 染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以及表达水平。 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。 鉴定方法 PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot 基因转移鼠纯合鼠系的建立 × 转基因杂合鼠 未转基因鼠 生殖系细胞中不含转入基因 生殖系细胞中含转入基因 子代多次交配可得到纯合转基因鼠系 三、转基因动物的应用 分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。 建立人类疾病的转基因动物模型。 基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。 人类疾病的转基因动物模型 完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。 为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。 转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。 人类疾病的转基因动物模型 各种人类遗传病的鼠模型，如： 老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、 关节炎(arthritis)、 肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、 肿瘤发生(tumorigenesis)、 高血压(hypertension)、 神经退行性疾病(neurodegenenerative disorder)、 内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、 动脉硬化症及其他很多疾病。 利用转基因动物反应器生产药用蛋白 转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物反应器等。 抗凝血酶 III：转基因绵羊的乳汁中。 β乳球蛋白 红细胞生成素 凝血因子 VIII 凝血因子 IX 生长激素 转基因改良移植器官