抗体工程,蛋白质工程（参考）.ppt

* * 蛋白质改造是基于蛋白的结构和功能的基础上进行的。 * 例如：干扰素是一种动物体内的抗病毒、抗肿瘤的药物蛋白，但半衰期短,在体外保存相当困难，以及其需求量日益增加。于是我们要对现有的蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质来满足人类生产和生活的需要。 * 基因-表达（转录和翻译）-形成氨基酸序列的多肽链-形成具有高级结构的蛋白质-行使生物功能。 逆向思维。从预期的蛋白质功能出发-设计预期的蛋白质结构-推测应有的氨基酸序列-找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因） * 根据需要确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系，通过基因改造，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质； 在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质。 * 基因剪接：在酶分子的编码基因上剪去或接上一段核苷酸。 融合蛋白质 将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。（结构域的拼接） 这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性 脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与δ型受体结合的基本功能区域，干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。化学合成EnkN端5肽编码区，通过连接5肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。 大改 是重新设计与合成自然界本不存在的蛋白质分子。 即从蛋白质的氨基酸组成和顺序出发，设计并制造出一个全新的蛋白质，并使之具有特定的空间结构和相应的功能。 ① 定点突变注意尽量保护保守的残基，特别在高特异性、高活性蛋白操作时更应注意。 ②对糖蛋白的N糖基化位点（Asn-X-Ser/The-X-Pro）应予注意。分泌蛋白、穿膜蛋白的这些位点若改变，将影响其糖基化，则可能对生物活性有影响。故注意对天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸加以保护。 应注意 ③ 疏水氨基酸常出现在蛋白质活性中心区，故应保留脯氨酸（可终止α螺旋区），半胱氨酸（形成二硫键，这是分泌蛋白标志之一）。 ④α螺旋，β折叠区一般不会存在酶的活性中心及底物的结合中心，只是结构支架。而环区，转角区和带电荷区多位蛋白质表面，可能是底物结合区和配基结合部位，应予注意。 ⑤ 对于有内含子的基因序列，可以试着去删除某一外显子，观察对功能影响。由于单个外显子一般编码独立折叠结构删去后不会影响其余部分的折叠。 ⑥ 构建嵌合蛋白时，若是同源蛋白嵌合体（30%同源），结合部应是相同或相近功能氨基酸；若是非同源原蛋白质，接合部应在预测结构的边缘。 ⑦ 缺失突变，尽量不用天然存在RE酶切位点进行删除，因为那样可能会破坏正确的ORF或影响蛋白质折叠。 ⑧ 若是对结构一无所知，可采用随机插入六聚体接头研究功能性结构域，由于只插入2个氨基酸，对整体功能破坏较轻。 目前主要集中在对天然蛋白质（酶）作以改变，克服缺点，扩大增添优点。其长远目标是创造人类所需各种性能优越的人造蛋白质。 * 自1975年单克隆抗体杂交技术问世以来，鼠源单克隆抗体（mAb）被誉为神奇的子弹，广泛用于临床检测诊断。 * ① 制备纯化抗原，加上佐剂后，免疫小鼠，加强免疫，并检测小鼠体内抗体，判断存在免疫应答，若效价高进行以下操作。 ② 杀死小鼠，取脾，分离脾淋巴细胞（能产生特异抗体）。 ③ 从骨髓瘤细胞中，采集可无限生长的B淋巴瘤细胞（最好用缺陷型瘤胞，如HGRPT缺失，便于筛选）。 ④ 将两种细胞融合，一般用PEG介导融合，用HAT培养基选择出能生存的杂交瘤细胞。 ⑤ 分离杂交瘤细胞，并通过有限稀释法获得单个细胞的克隆，在杂交瘤细胞的培养中，应加入能分泌生长因子的饲养细胞（如小鼠腹腔巨噬细胞等），以帮助杂交瘤细胞生长存活，同时还能清除死亡细胞。 * 骨髓瘤细胞：为HGPRT基因缺陷型细胞，不能合成DNA。需经应急途径合成DNA。HAT培养基含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻断骨髓瘤细胞的应急DNA合成。所以骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长存活. * 融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗