液相色谱培训ppt.pptx

高效液相色谱培训 基本原理和特点液相色谱仪器部件实验操作与应用基本原理和特点基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。岛津液相色谱仪结构流动相柱温箱进样口检测器主泵 副泵启动液相色谱仪器的流程 开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、检测器电源， 待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件准备流动相 过滤，脱气色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵高效液相色谱仪组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统 HPLC色谱柱数据处理系统溶剂自动进样器检测器 色谱泵废液液相色谱流程图液相柱---保留值与pH的关系色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH：2.52.6温度： 50℃流速： 1.0mL/min. pH变化值0.1RS变化值1.6 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱 对溶剂的要求水： 去离子水 自动纯水仪　纯净水　　 商品瓶装水溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）　试剂: 分析纯不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。 过滤与脱气过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 流动相的保存有机溶剂流动相： 室温下密封，避光保存缓冲盐流动相： 当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相： 低温密封保存 防止有机相的挥发选用适宜的容器液相色谱的色谱柱色谱柱的连接 Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 色谱柱的连接 锥箍锥度不合适造成渗漏 可能提高柱效的方法除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固定相。 色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。 采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。HPLC检测器应提供的功能对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性灵敏度：信噪比6:1SN灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N = 2~4定量限（LOQ）：S/N = 8~10好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度/均一性 吸光度（Absorbance UV/Vis）检测目前实验室中最流行的选择多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA）测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大Parabens at 254 nm0.150.10AU0.050.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Minutes吸光度检测器（UV/Vis）－ 优点这种检测器简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长受流动相组成的影响：用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响 图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统溶剂混合的基线噪音色谱条件色谱柱： C18, 5 μm, 3.9x150mm at 35o C.流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile.梯度：