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水分胁迫对大豆幼苗光合作用相关基因表达的影响 陈四维 作物遗传育种 大豆是我国的主要粮食作物和经济作物，干旱缺水是影响其生长和发育的主要因素之一[1]。干旱胁迫常常影响植物的生长发育导致作物的严重减产。大豆幼苗干旱会造成叶柄长度缩短，叶柄与主茎夹角减少，叶面积缩小[2]。在大豆受到干旱胁迫的影响时，不仅叶面积会缩小的趋势，叶绿素的含量也会明显减少[3]。有研究表明，干旱还会破坏叶绿素的活性，同时影响气孔导度，使得净光合速率下降[4]。干旱胁迫下豆荚数明显减少，并且结荚长度明显也减少，进而减少产量[5]。光合作用是与农作物产量、品质关系最为密切的代谢过程。通常，占植物干重90% ~95%的有机物质都是来自光合作用。光合作用可大致分为3个步骤：（1）原初反应；（2）电子传递和光合磷酸化；（3）碳同化过程。碳同化过程是将活跃的化学能转化为稳定的化学能的过程。碳同化的第一阶段为羧化阶段，指核酮糖-1，5-二磷酸在核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）催化下，与CO2结合，产物形成2分子3-磷酸甘油酸[6]。电子传递途径和碳同化过程需要各种酶的参与，这些酶由相应的基因控制其合成与降解，进而影响光合作用的进程。 本试验采用PEG-6000对大豆幼苗进行根际水分胁迫，选取Rbls (Rubisco的一个亚基)、NDH-H、PGR5（质子梯度调控蛋白）和PTOX（质体末端氧化酶氧化酶控制基因）四种光合作用相关基因，并利用RT-PCR技术对扩增产物进行半定量，探究水分胁迫对大豆幼苗这四种基因表达的影响。为进一步研究水分胁迫下大豆光合作用途径变化奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 选取PEG-6000（聚乙二醇）对大豆幼苗进行根际水分胁迫后有明显表型的叶片，以及正常处理（CK）的叶片。 1.2材料处理 选取两盆长势相同的大豆幼苗。将PEG-6000用蒸馏水配制成浓度为10%的溶液，取其中一盆植株置入所配溶液中进行根际水分胁迫，胁迫时间为1天。用未胁迫的幼苗作对照，取叶片作为实验材料。 1.3实验操作步骤 1.3.1总RNA的提取 取0.1 g叶片在液氮中充分研磨后，转入预冷的离心管中，再加1 ml的TRNzol充分混匀。将匀浆样品在室温下放置5 min。加入氯仿至管口，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。4 ℃、12,000 rpm离心10 min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中。取500 μl水相，转移到新的离心管中。再加入500 μl异丙醇，混匀，室温放置20 min。4 ℃、12,000 rpm离心10 min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。加入1 ml的75%乙醇洗涤沉淀。然后倒出液体，注意不要倒出沉淀。室温放置晾干（大约晾干5-10 min），加入20 μl的RNase-Free ddH2O（RF-H2O），反复吹打、混匀，充分溶解RNA。完成后-70 ℃保存。 1.3.2 RNA样品的检测及浓度的测定 在两只已清洗干净的石英比色杯中各加入3 ml去离子水，测定260 nm和280 nm的光吸收值。一般而言，两只比色杯空测，其差别不能大于0.010, 最好是在0.005以下。在已加入3 ml灭菌水的待测样品比色杯内，加入5 μl的RNA样品，用枪头搅拌均匀。先观察光吸收值是否恒定。如果显示的数值频繁改变，表明样品未混合均匀，应再用枪头搅拌。当数值恒定时，记录OD260和 OD280。全部测量完成后，按如下公式计算RNA的浓度：OD260×40×稀释倍数，单位为ng/μl。例如：40 ng/μl×0.164（O.D.值）×3005 μl（比色体系总体积）/5（取了5 μl样品）。再计算OD260/ OD280，其值至少应为1.7，最好是1.8-2.0。所有样品测定完后，按相同RNA的量（所取体积在2-3 μl），加6 × loading buffer，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性及量的差异。做到每个样品的条带亮度一致。 1.3.3反转录合成cDNA第一链 在冰浴的离心管中加入如下反应混合物：1 μg的总RNA （预先计算体积）；1 μl的Oligo dT；2 μl的dNTP（2.5 mM each）；补RNase-Free ddH2O（RF-H2O）至14.5 μl。70℃加热5 min后迅速在冰上冷却2 min。加入如下试剂：4 μl的5 × First-Strand Buffer（F-S buffer）；0.5 μl的RNasin；1 μl的M-MLV反转录酶然后轻轻用移液器混匀。42 ℃温浴50 min。95 ℃加热5 min终止反应，所得cDNA置冰上进行后续实验或-70℃保存。 1.3.4 P