第三章_细胞生物学研究方法.ppt

2、密度梯度离心 第二节 细胞组分分析技术 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。 速度区带离心用于分离密度相近大小不一的细胞组分 等密度梯度离心用于分离不同密度的细胞组分 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 速度区带 梯度介质最大密度小于样品颗粒最小密度 要控制好离心时间 分离密度不等的颗粒 等密度梯度离心 梯度介质最大密度大于样品颗粒最大密度，样品密度介于梯度密度最大与最小之间，样品不能到达离心管底部。 二、细胞组分分析 细胞化学技术：细胞学和化学的结合产生了细胞化学,主要是研究细胞结构的化学组成及化学分子的定位、分布及其生理功能, 包括定性和定量分析。 包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影示踪细胞化学技术等。 第二节 细胞组分分析技术 二、细胞组分分析 酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。 免疫标记技术：特异性蛋白抗原的定性、定位分析——将免疫学方法与荧光标记技术、酶标记技术、金标技术等相结合用来研究特异蛋白在细胞内分布的方法。（选择11） 原位杂交技术（In situ hybridization）：特异核酸序列的定位、定性分析。（选择题12-16） 放射标记技术：研究生物大分子在细胞内的合成动态（选择题17） 第二节 细胞组分分析技术 原位杂交技术将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。 Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。 Northern杂交用来检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。检测蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。 In situ hybridization for RNA localization in tissues. Electron-microscopic autoradiography 第二节 细胞组分分析技术 三、定量细胞化学技术 显微分光光度技术 流式细胞仪 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 计数、分类、测定等 第二节 细胞组分分析技术 细胞工程 应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术，按照人们的需要，有计划地大规模地培养生物组织和细胞，以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传组成以获得新的种或品种，为社会和人类提供需要。 第三节 细胞工程与细胞培养 细胞培养 概念：在体外模拟体内的生理环境，使从机体取出的细胞在体外继续生长繁殖的技术 包括：细菌培养、动物细胞培养和植物细胞培养 在细胞培养中防止污染是决定细胞培养成败的关键。 第三节 细胞工程与细胞培养 动物细胞培养术语 原代培养（primary culture）：从动物机体取出直接进行培养的细胞群叫原代细胞，对原代细胞的培养称为原代培养。 传代培养：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。 将细胞从一个培养瓶以一定的比例转移到另外的培养瓶继续培养的过程，即称为传代或传代培养。 第三节 细胞工程与细胞培养 2、活细胞观察技术 相差显微镜 微分干涉显微镜 录像增差显微镜 倒置显微镜 第一节 细胞的形态观察技术 （1）活细胞观察技术—相差显微镜 原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 特殊构造：相差物镜、环形光阑、合轴调中望远镜、绿色滤光片 第一节 细胞的形态观察技术 相差显微镜的应用 特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察未经染色的活细胞。 第一节 细胞的形态观察技术 （2）活细胞观察技术—微分干涉显微镜 特点：以平面偏振光为光源，能区分样品厚度的微小差别，增加样品反差，有立体感。 应用：观察未染色标本，更适于研究活细胞中较大的细胞器 （3）录像增差显微镜—计算机辅助的微分干涉显微镜 降低背景噪声，提高分辨率，填补光镜与电镜之间的空白 第一节 细胞的形态观察技术 （4）活细胞观察技术—倒置显微镜 应用：通常具有相差物镜，用来观察正在培养的活细胞 第一节 细胞的形态观察技术 3、特殊光学显微镜—荧光显微镜 光源：汞灯—短波长紫外光 装置：激发滤光片、阻断滤光片、分色镜 荧光染料染色 应用：在光镜水平对细胞中特异的蛋白质分子或核苷酸片段等进行定位、定性分析。 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP ） 第一节 细胞的形态观察技术 3、特殊光学显微镜—荧光显微镜 第一节 细胞的形态观察技术 Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubul