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* 宝生物工程（大连）有限公司, 116600 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. RNA干扰 (RNAi) 技术介绍 (RNAi ：RNA interference) RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指内源性或外源性双链RNA（dsRNA）介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功 能表型的缺失现象。 这一现象属于转录后的基因沉默机制 (Posttranscriptional gene silencing，PTGS)。 What is RNAi ? 后基因组研究的焦点：基因功能研究 抑制基因表达 观察功能变化 Knock Out 法 Antisense法 Ribozyme法 RNAi法 报 告 内 容 ● RNAi 的历史背景及机理 ● siRNA 的制备方法 ● RNAi 技术的应用 转录后基因表达抑制现象的发现 ＋ CHS Gene 矮牵牛花 (Jorgensen, R, 1990) RNAi 现象的发现 线虫（C. elegans) (Guo Kemphues, 1995) Antisense RNA or Sense RNA + Par-1 Gene Disruption Expression Down RNAi 现象的发现 (Fire, 1998) 线虫（C. elegans) Sense RNA + Par-1 Gene Disruption Expression Down 线虫（C. elegans) Antisense RNA + Par-1 Gene Disruption Expression Down RNAi 现象的发现 线虫（C. elegans) (Fire, 1998) + Par-1 Gene Disruption Expression Down Double Strand RNA 线 虫， 果 蝇 微生物， 植 物 RNAi 的主要物质：siRNA Size : 21-23 base, two nucleotide overhang 5’Terminal : Monophosphate 3’Terminal : -OH, Can be modified （Tuschl, 1999） siRNA (Short Interfering RNA)结构 5’P 3’OH P 5’ OH 3’ siRNA生成：dsRNA分解酶 Cell Membrane dsRNA Dicer siRNA Helicase PAZ RNase III RNA binding domain MW: 220,000 Dicer RNAi 的作用机理 RISC: RNA-Induced Silencing Complex Exonuclease Homology search activity Endonuclease Helicase 5’ 3’ Target mRNA OH3’ 5’P dsRNA Dicer cleavage of dsRNA siRNA RNAi 抑制基因表达的机理 siRNA associated With RISC complex Cell Membrane 5’P OH3’ Target mRNA 哺乳动物细胞中的 RNAi 现象 长链dsRNA 所有基因表达下降 RNAi 现象 PKR, RNase L 活性化 X 干扰素 5’P OH3’ 3’ OH P5’ 21mer 短链dsRNA 抑制靶基因表达 RNAi 现象 RISC 结合 (Tuschl, 2001) 哺乳动物细胞中的 RNAi 现象 5’P OH3’ 3’ OH P5’ 5’P OH3’ siRNA：short interfering RNA miRNA: microRNA 另一种 RNAi 现象：miRNA 的发现 Precursor of miRNA Dicer miRNA miRNP Lin-4 分解mRNA 抑制mRNA的翻译 miRNA 抑制基因表达的机理 报 告 内 容 ● RNAi 的历史背景及机理 ● siRNA 的制备方法 ● RNAi 技术的应用 siRNA 的制备方法 ●体外合成法 1. 化学合成法 使用DNA/RNA合成仪进行化学合成。 2. 体外转录合成法 构建载体进行体外转录合成。 ●体内合成法 使用各种表达载体进行生物体内合成。 体外转录合成法 生物体内合成 表达载体使用Promoter种类 U6/ H1 Promoter tRNA Pr