第三章海洋药用活性化学成分分离分析的基本方法.ppt

②反向离子对层析： 固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。 离子对分配层析： 离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。 离子交换层析： 1、高压输液系统：高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 HPLC系统的组成： ①溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 HPLC系统的组成： ②对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。 HPLC系统的组成： ③梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。 HPLC系统的组成： ③梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混 合，再输至柱系统。 HPLC系统的组成： 2、 进样系统：进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。 HPLC系统的组成： 3、分离系统：分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。 色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。 HPLC系统的组成： 4、检测器：检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。 HPLC系统的组成： 检测器：在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等； 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。 HPLC系统的组成： HPLC系统的组成： 高效液相层析（HPLC）示意图 一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。 HPLC流动相的选择： ①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。 HPLC流动相的选择： ②纯度： 色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。因此，溶剂系统在使用前都必须过滤。  HPLC流动相的选择： 凝胶柱的制备和操作： 用于凝胶层析的层析柱，一般柱长度不超过100 cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。 凝胶柱的制备和操作： 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10 倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1～2 小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液。 将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升直到所需高度为止。 凝胶柱的制备和操作： 平衡凝胶床过夜使用前，要检查层析床是否均匀、有无纹路或气泡或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄均匀平整，说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲散乱