DNA的琼脂糖凝胶电泳.ppt

DNA的琼脂糖凝胶电泳 一、实验原理 电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。 电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。 根据其载体介质的不同可分醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。 核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中通过琼脂糖凝胶向阳极移动。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。 DNA在电场中的迁移率的影响因素 1）DNA的分子大小、形状、构象。 2）琼脂糖的浓度。 3）所加电压。 4）嵌入的染料。 5）电泳缓冲液的组成。 琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。 用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。 琼脂糖凝胶电泳的优点 1）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（98%～99%），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 2）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。 3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 琼脂糖凝胶电泳的应用 用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分离。现广泛应用于核酸的研究中。 按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，是分析鉴定基因工程重组DNA 分子的重要实验手段。 是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科学界的高度重视。 试 剂 1、Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水，定容至1000mL。 2、琼脂糖： 1g 溶于TBE缓冲液中加热配成100mL。 3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×Loading Buffer ） ：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 4、0.5μg/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。） 5、DNA Marker 1、水平板型电泳槽 2、直流稳压电泳仪 3、微量移液枪 4、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行凝胶图像的实时观测 三、操作方法 1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。 2、凝胶板的制备 置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。 待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电泳槽平台上。倒入TBE缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。 3、加样 将待测DNA样品液与5×Loading Buffer以4：1的体积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10μL左右。 加样时，使样品集中沉于槽底部。 DNA Marker取5μL直接进行加样。 点样时应注意哪些问题？ 点样位置：靠近负极一端凝胶凹槽 注意移液枪枪头不要损坏凝胶槽 点样后在凹槽内移液枪不能倒吸 点样后不能再移动电泳槽位置 4、电泳 加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。 样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。 5、染色 将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。 6、观察与拍照 小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下进行观察。 DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。 四、实验结果 打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实验结果进