小麦萌发前后酶活性比较.doc

实验六 小麦萌发前后淀粉酶活性的比较 姓名： 班级：生工 学号 组员： 指导老师：吴老师 前言 淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用生成麦芽糖、葡萄糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。按照其水解淀粉的作用方式， 可以分成α—淀粉酶、β—淀粉酶等. 实验证明，在小麦、大麦、黑麦的休眠种子 中只含有β—淀粉酶 淀粉酶， α—淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发淀粉酶的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。 本实验以淀粉酶催化淀粉生成还原的性糖的速度来测定酶的活力，淀粉水解 成还原性糖，还原性糖能使3，5—二硝基水杨酸还原成棕色的3—氨基5—硝基水 杨酸。可用分光光度计法测定， 2(C6H10O5)n + nH2 → nC12H22O11。 一、实验目的 ? 学习分光光度法测定酶活力的原理与方法 ? 了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化 二、实验原理 ? 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。实验证明，在某些植物如小麦、大麦的休眠种子中只含有β–淀粉酶，α -淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。 本实验以淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖的速度来测定酶的活力。麦芽糖是还原性糖，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者在500 nm处有最大吸光度，而进行定量测定。 三、实验主要试剂与器材： ? 实验仪器： （1）20mL试管7支 （2）不同量程移液管若干 （3) 可见分光光度计 （4）离心机 （5）恒温水浴 （6）研钵 (7)移液枪 ? 实验用品： （1）小麦种子（休眠和萌发各十颗） （2）1%氯化钠溶液 （3）标准麦芽糖 （4）0.2%淀粉溶液 （5）3，5-二硝基水杨酸溶液 （6） 0.02 mol/L 磷酸缓冲液 四、实验操作步骤： ? 麦芽糖标准曲线制作 取 7 支干净的具塞刻度试管，编号，按下表加入试剂： 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 3，5-二硝基水杨酸 2 2 2 2 2 2 2 摇匀摇匀，置于沸水浴中煮沸 5 min 。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 m L 。以 1 号管作为空白调零点，在 500 nm 波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 2、萌发小麦种子 浸泡小麦种子24h ，入25°C恒温箱或在室温下发芽。 3、提取小麦萌发前后的酶液 （1）幼苗酶的提取：取萌发的幼苗10株，入研钵加石英砂0.2 g，1 % NaCl 3 ml，研磨成匀浆，0-4 °C下放置20 min。 离心，2000 r/min 10 min .测定上清酶液的总体积。 （2）种子酶的提取：取干燥种子10粒作对照，操作方法同上。 4、二硝基水杨酸法测定酶活力 量取待测酶液1 ml，pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释10倍，作为酶活力测定物。取6根试管按下表加各物质：表2 试剂 试管编号 1/2（种子酶稀释液） 3/4（幼苗酶稀释液） 5/6(空白管） V（稀释溶液）/ml 0.5 0.5 —— V（0.2%淀粉溶液）/ml 1 1 1 V（蒸馏水）/ml —— —— 0.5 混匀各管，40 °C恒温水浴，水解3 min， 加入1% 3，5-二硝基水杨酸溶液2 ml。入沸水浴，准确加热5 min，迅速冷却至室温，加水稀释至20 ml，混匀。 测定各管的A500nm值 五、实验数据处理： 1、标准曲线的测定：以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。（已知标准麦芽糖浓度为3.6mg/ml） 麦芽糖含量（mg) 吸光度值 0 0 0.72 0.046 1.44 0.191 2.88 0.469 4.32 0.766 5.76 0.936 7.2 1.262 标准曲线： 2、小麦干种子酶及幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的光吸收值： 试管编号 1 2 3 4 5 6 吸光度值 0.234 0.219 0.468 0.516 0 0 平均值 0.227 0.492 0 其中1、2号管是小麦干种子，3、4号管是小麦幼苗，5、6号管属于空白管。 将上面实验数据带