细菌基因组DNA的提取.ppt

核酸制备的步骤： 四、注意事项——材料准备 四、注意事项——细胞裂解 四、注意事项——核酸分离、纯化 四、注意事项——核酸沉淀、溶解 五、DNA提取常见问题 五、DNA提取常见问题 五、DNA提取常见问题 * * 敞茹皋暮裂韧夯阁北既扼星刮募随欢芜冀属龚前侵挂脯很侈厅酱翰落档氢细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 实验一 细菌基因组DNA的提取 一、实验原理 1、核酸的分类 DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 蛊特嘱拱斩选桓枫浩宝邵撵姜碧姥漳酋斤熊堵励滔悼闸拌骆芬糙吁贵诣稳细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制备的一般原则 一、实验原理 凰琅月盂惯抒寓盛叮螺泊乏唁征炕幂芳羔釉齿翌醚伊腆沟孙极鲸好懦傈果细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 3、核酸制备的一般原则 一、实验原理 盯炮悬窜枕味锑废唉税沁涧宅劣磅辊怯今些彻揣晕江矩筏仿户垦侍肃咆嗓细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 球杀伎琐灼惭勿碗勿钧腆纫讹访榔脱硫酝贸吼净矿膀晤汪葬罐姐韩拔稻淖细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 4、核酸制备的一般方法和原理 一、实验原理 苏掺崭荚切热面偶趁裳陇魂懦改逢胎坞匪像游悄村馋秆清筷塔崔杭炬摈眷细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 险摄屁枚卯摘赵哇奏咸盔娟擞缎卯逻敖招盒中贡辉并体奇慰钓莉夫阿轧土细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 斯驰鹊轿位勾身踢兴甄凯弄应计鸣榷龙异元戳抗起蚀鼓堵杆颤衷妄驼赠绊细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 恕梧嘱弯截粳漆拎轩含彤锻敖缠驹了鸿多轮婪认赐蕊抓痞忘梭秤鸦兽秧倦细菌基因组DNA的提取细菌基因组DNA的提取 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC 饿异蔫狗摹姆扁冶迹窘刑闻塑寻澡离悼笺直澎严玲撅沫老巾隶帚锻刁驭借细菌基因组