人类染色体疾病的诊断(三)学习指导书.ppt

五、几种新技术介绍 1.多色荧光原位杂交（M-FISH） 采用全染色体探针（WCP）与染色体杂交，分析染色体数量和结构异常的 分子生物学方法。 探针是经过聚合酶链反应(Degenerate oligonucleotideprimed polymerase chain reaction, DOP-PCR)扩增、 流式分选、 并用 5 种荧光素组合荧光标记法标记的 同源染色体。这种经过标记的探针集合(Pool) 与制备好的间期细胞染色体杂交, 可使杂交后的每 条染色体表现出独有的颜色, 从而能够分辨出人的 22 对常染色体和X、Y 两条性染色体(图2[15]), 杂交 后的图像通过滤光装置被计算机获得并分析得出结 果。如果一条染色体的颜色不相同, 则提示 该条染色体有重组现象, 根据每条染色体各自独有 的颜色, 可以知道哪几条染色体之间进行了重组[ M-FISH 对染色体间复杂易位的分析有突出优势, 但是对染色体微小易位(1MB)的分析则受到限制, 而对染色体内部异常的分析则无能为力, 这包括染色体的扩增、微小缺失和倒位 染色体光谱核型比对分析技术（SKY-spectral-karyotyping)-创新的染色体数目和结构异常检查工具 　　原理：光谱核型分析SKY经由CCD相机撷取图像，利用光谱干涉仪及傅立叶转换技术，分辨获得图像每一像素点的光谱，以此标定出不同光谱的不同颜色。 　　优势： 对比传统的M-FISH,光谱核型分析技术的采用优势无法比拟。 　　一 传统的技术使用显微镜荧光滤镜来分辨荧光信号，缺点存在严重的荧光信号干扰（cross-talk),信号重叠，信号位移等，无法有效分辨染色体，也无法准确诊断染色体的细微变异，异位。而SKY完全克服以上缺点，对图像每一像素的光谱标以不同颜色，显而易见。 　　二 从成本上看，不需要电动显微镜，荧光滤镜仅使用一颗SKY滤镜，SKYPaint探针做一次杂交，一次图像撷取，让使用人员减轻时间，精力，同时获取稳定结果。 4. 比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization (CGH) 原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析 是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具 比较基因组杂交（CGH） CGH不需要制备患者的染色体标本, 只需采用肿瘤患者的基因组DNA和正常人的基因组DNA作为探针，与正常人的中期染色体分裂相进行杂交。比较两种探针所标的荧光信号的强度比率来判断肿瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或复制。 因而CGH最适合于检测实体瘤, 淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病. CGH另一无法替代的优点是, 它可在一次杂交中检测整个基因遗传 物质的增加或减少, 但精度有限, 对微小的扩增或缺失检测不出, 仅适用于对整个基因组进行筛查. CGH也无法发 现平衡染色体易位. 比较基因组杂交原理示意 肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失 等比混合 比较基因组杂交过程 DAPI 4’,6-二联脒-2- 吲哚苯 FITC 异硫氰酸酯 TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明 人染色体不同荧光素染色结果 数字化图像 FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC 比较基因组杂交应用范畴 可在基因组水平上对染色体变异部位进行准确的定量定位分析； 不需要细胞培养可对肿瘤基因组DNA的拷贝数进行定性分析与定量分析； 对细胞遗传学难以判断的肿瘤染色体的某些成分（如双微体、标记染色体）的来源进行鉴定； 快速检出染色体三体性、单体性和部分染色体大片段重复的拷贝数变化，有利于对先天畸形、自然流产等疾病进行快速诊断。 优势： 可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道DNA发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减 多色信号采集 常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标记探针的应用，使用CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统融合各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。 FISH和G显带技术结合 对已做过G显带的染色体片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）,不仅可以用新近G带外理过的片子，而且