基因工程综合实验.doc

摘要 本次实验通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验方法，采用A mp抗性筛选，利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子，然后在进行相应的鉴定试验，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词 菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定 引言 在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割 大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致 二、 实验原理 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。 从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致. 三、使用仪器、材料 1、材料 实验九准备好的菌株。 2、设备用具 PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、主要试剂 PCR： 10 × PCR buffer 、rTaq 酶 dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM 引物(2.5μM) P1 ：GFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ (Tm=65.5℃) (Sal I) P2:GFP-R: 5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’ (Tm=61.5℃) (Xba I) 1.5% 琼脂糖凝胶 配制LB液体培养基： 称胰蛋白胨0.2g，酵母提取物0.1g，NaCl 0.2g于100ml的三角瓶中，加入20ml蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH调pH至7.5，加塞，包扎瓶口。 质粒提取： 溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0）， 用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V） TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含RNA酶（RNaseA）: 20 μg/ml 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇 限制性核酸内切酶： Sa l I和 RcoR I 10×H buffer 苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、 无水乙醇、70%乙醇等 实验步骤 （一）转化子的筛选 取连接反应转化原液100uL，涂布与筛选培养基上，直至液体被完全吸收。 倒置平板于37℃继续培养16个小时，平板所长出的单菌落（为白色的）即为转化子。 （二）菌落直接PCR ①用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落,在编好号码的PCR反应管中的底部分别涂抹,然后在PCR管中配制15μL反应体系.. 10 x PCR buffer 1.5μl dNTP mixture 1.2μl 前向引物 (P1) 2.4μl 反向引物 (P2) 2.4μl