基因工程讲义.doc

第一章 绪 论 一、什么是基因工程技术？ 生物技术（biotechnology）：又称为生物工程（bioengineering），是指运用现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先设计改造生物体或加工生物原料的技术。包括基因工程、细胞工程、蛋白质（酶）工程、发酵工程等。 遗传工程(genetic engineering)：人工改造生物体遗传性的技术。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程等 。 基因工程（gene engineering） ：在基因（DNA）水平上，用分子生物学的技术手段来操纵、改变、重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状按要求发生定向的变异，并能将这种结果传递给后代。简单地说，就是在分子水平上改造和设计生物的结构和功能的技术。 其核心内容是重组DNA技术：从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程. 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。克隆作动词时是指基因的分离与重组过程。克隆还可以在动物、植物的无性繁殖中使用。 二、重组DNA技术基本步骤：(切、接、转、增、检） 1、施工材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 2、目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。 3、把重组的DNA分子引入受体细胞。 4、重组DNA分子大量繁殖，建立起无性繁殖系。 5、筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。 三、基因工程的发展史 1 理论上的三大发现 1）生物的遗传物质是DNA。2）双螺旋结构，半保留复制模型。3）遗传信息的传递方式（中心法则）。 2 技术上的三大发现 1）第一种限制性核酸内切酶以及DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）。2）载体的使用。3）发现逆转录酶。 3 基因工程的诞生：1）首次体外重组实验——将SV40的DNA片段与噬菌体的DNA片段连接起来。2）抗四环素和卡那霉素的重组菌落TcrKmr，标志着基因工程的诞生。S Cohen被誉为基因工程的创始人！ 已测序的重要模式生物： 人、家鼠、果蝇、线虫、拟南芥、水稻、大鼠、斑马鱼、酿酒酵母、番茄、玉米、布氏锥虫 菜豆、河豚、大肠杆菌、HIV、牛、疟原虫。 四、基因工程的意义 基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型 。概括地讲，其意义体现在以下三个方面：1）大规模的生产生物分子。2）设计构建新物种。3）搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息。 1、农业——掀起新的绿色革命 1）抗病虫。2）提高品质。3）提高花卉的观赏价值。4）抗逆性。5）家畜。瘦肉比、饲料利用率、加快生长。 如①生物固氮工程，将豆科植物的固氮基因转移到其他作物中去，使其自行固氮，以解决氮肥的问题。②利用转基因工程，可以得到抗病、耐寒的农作物或牲畜。③将大豆的高蛋白基因转移到水稻增加蛋白质含量。 2、工业 轻工业、能源工业。 表现在：啤酒酿造，白酒和黄酒的酿造和酒精生产，干酪，“吃油”工程菌，纤维素酶。 3、医药 重组药物，基因治疗，检测遗传疾病、病原。 4、环保 1）可以利用转基因微生物分解和降解污染物。2）培育出能分解污染物的植物新品种。 5、其他方面：利用基因检测及时鉴定身份。 基因工程的可能的负面影响： 1）制造难以制服的病原体和生物毒剂。2）转基因的超级细菌、病毒从实验室逃逸。 如果基因工程没有规则，则可能给人类带来难以预测的危害！ 第二章 基因工程操作的基本技术 琼脂糖电泳技术 琼脂糖电泳用途：①判断PCR扩增片断的大小。②回收PCR扩增片断。③用于转印进行Southern印迹。 琼脂糖电泳结果的影响因素 ①凝胶浓度。②电泳液。③电泳的电压和时间。④样品的上样量。⑤检测手段。 琼脂糖凝胶浓度的选择： 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。 2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过20kb 。 3、不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 凝胶制备的注意事项： 1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜）。 2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长。 3、EB含量要适当。 4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化。 5、检查梳子。 6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度。 7、凝胶稍厚些，避