内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心学习指导书.pptVIP

DNA 重 组 实验原理 实验仪器 实验步骤 实验试剂 注意事项 实验原理 外源DNA 与载体分子的连接就是DNA 重组，这样重新组合的DNA 叫做重组体或重组子。重组的DNA 分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体DNA 连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA 分子连在一起的功能，而且T4 噬菌体DNA 连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4 噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅助因子ATP 形成酶-AMP 复合物；然后，酶-AMP 复合物再结合到具有5 ’磷酸基和3 ’羟基切口的DNA 上，使DNA 腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。 DNA 重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP 处理克服。 连接反应的温度在37 ℃ 时