湖州师范学院基因工程复习提纲.doc

基因工程复习重点 一、载体PTXBⅠ Ori 原核生物复制起点 T7 promotor T7启动子 是最强的启动子，指导转录起始。 Lac opterator 乳糖操纵基因，可被Lac I编码的阻遏蛋白结合抑制转录。 SD 原核生物翻译起始时核糖体的识别序列 位于mRNA上 MCS 多克隆位点 可插入外源基因，不影响其复制。内含多个酶切位点、如图。 Intein 内含肽 CBD chitin binding domain（几丁质结合位点）可与Tag（亲和标记）结合 Stop code 终止密码子 Amp氨苄抗性基因 可用作抗性筛选的重要标记 Lac I 乳糖调控基因 编码阻遏蛋白 二、质粒提取原理： 答：三种溶液： 溶液1：50 mmol/l 葡萄糖- --维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解； 25 m mol/l Tri· Cl （pH 8.0)维持 pH; 10 m mol/l EDTA (pH 8.0)螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA 溶液2：0.2 mol/ NaOH核酸变性（pH12或pH3) (解链） 1% SDS蛋白变性，裂解细胞。 溶液3：7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) 沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。 其它溶液： (1)2M NH4AC沉淀蛋白，溶解核酸； (2)异丙醇沉淀质粒 (3)70％乙醇沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase除去细菌RNA 过程及作用： 1.5 ml 菌液， 12000 rpm * 1 min, 弃上清 （repeat) －－收集细菌 溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液 溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性 溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性 13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA 540 ul 异丙醇， 室温 10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质 100 ul 2M NH4AC 13000 rpm* 5 min, 取上清； 100 ul 异丙醇，室温10 min; 14000 rpm * 10 min, 弃上清； 70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分 烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇 50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA 电泳鉴定 三、连接反应 答：1、总体积为10 ul ； 2、16 ℃连接过夜；（为什么是16 ℃？答：连接反应包括两步一是将碱基50%连接（变性）：Tm=2（A+T）+4（G+C），一般在8℃左右。二是将连接末端、DNA连接酶最适温度在37 ℃左右。综上，要两个同时很好的进行，就将温度调到16 ℃左右。） 3、基因mol /载体mol≈ 10 ; 【 平端≈ 15】 四、重组克隆的筛选，各方法的优缺点。 答：1、抗性筛选； 原理：利用载体上具有的抗性基因，进行筛选。 优点：可确定有无载体转入。 缺点：不能保证外源基因插入，空载体不能被检测出来。 2、蓝白斑筛选； 原理：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）－－蓝斑；外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行α互补－－白斑。 优点：未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选 缺点：无法确定基因插入的方向；基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生α互补，产生蓝斑。 3、酶切电泳筛选(*)； 原理：选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。 优点：可鉴定外源基因的重组和插入方向。 缺点：结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变。 4、PCR筛选； 原理：通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒 优点：可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测重组子。 缺点：不能检测基因插入方向；不能检测基因内部突变。 5、测序验证； 原理：选取阳性克隆，送公司测序； 优点：最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。 缺点：价格贵，适于1～2个克隆的验证。 6、表达筛选； SDS 原理：小量诱导表达；全菌液裂解后进