双缩脲法测定蛋白质含量.pptVIP

实验三　双缩脲法测定蛋白质含量 原理 蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2＋形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸成份无关。 在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540～560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线，求出未知样品的蛋白质浓度， 注意 1、除－CONH-有此反应外——CO NH2， -CH2-NH2，-CS- NH2等基团亦有此反应。 2、双缩脲法常用于蛋白质的快速测定 。 3、低浓度的铵盐不干扰结果；Tris及含氨基酸、多肽的缓冲被．以及蔗糖、甘油等干扰本实验。 4、反应完后，放置30min；灵敏度低1～20mg Tris:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 操作 1　　 2 3 4 5 标准酪蛋白（ml） 样品（ml） H2O(ml) 双缩脲试剂（ml） — 1.0 1.0 — — — — — 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 — — 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 室温放置30分钟，于540nm处比色 郎伯-比尔定律 1、公式描述 2、注意： 当A值在0.2~0.7之间或者T值在65~20%之 间，相对误差较小。 课后练习 1、记忆五种蛋白质浓度测定方法的优缺点、 灵敏度和原理。 2、双缩脲法显色的颜色是什么? 3、使用紫外－可见分光光度计时，测定A值应当在什么范围内比较合理？为什么？ 在pH=7的水中加入一种纯的蛋白质，形成蛋白质溶液后测定其pH为5.3，请问这种蛋白质的等电点(pI)在什么样的范围？