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实验三 高效液相色谱法测定黄酮类化合物 一 实验目的 掌握高效液相色谱法测定橙皮苷、橙皮素单糖苷和橙皮素；了解高效液相色谱仪的使用。 二 实验原理 1. 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法具有高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广等特点。 2. 黄酮类化合物是指以2-苯基色原酮为母核的一类化合物。橙皮苷、橙皮素单糖苷和橙皮素的结构见下图，这些化合物在284nm紫外光下有吸收。橙皮苷在鼠李糖苷酶作用下去除鼠李糖基得到橙皮素单糖苷，橙皮素单糖苷在β-糖苷酶作用下去除葡萄糖基得到橙皮素。 黄酮母核 橙皮苷（分子量610.56） 橙皮素单糖苷（分子量464.43） 橙皮素（302.28） 4.6 x 250 mm，5 micron10μl），其它参数为默认。 6. 运行和数据分析 点击“运行”图标，在弹出框中输入样品组名称，点击“确定”，HPLC开始自动进样分析。分析结束后，点击“数据查询”，选择样品组名称，点击样品名称，页面会显示图谱。点击“积分”图标，页面会显示出峰时间和峰面积等信息。 7. 关机 点击“平衡/监视”图标，启动泵，运行直至基线水平。退出工作站。 关闭电脑。关闭泵、柱箱、检测器和自动进样器的电源。 做好仪器使用记录。 六 实验结果 以酶水解时间（10、20和30min）为横坐标，橙皮苷和橙皮素单糖苷的积分峰面积为纵坐标作柱形图，描述0.2%橙皮苷在鼠李糖苷酶作用下的水解过程（注意该过程中有无橙皮素产生）。 橙皮苷，出峰时间3.844分钟， 峰面积5210623微伏·秒。 橙皮素单糖苷，出峰时间4.217分钟， 峰面积2585915微伏·秒。 橙皮苷，出峰时间3.838分钟， 峰面积3654052微伏·秒。 橙皮素单糖苷，出峰时间4.212分钟， 峰面积3567114微伏·秒。 橙皮苷，出峰时间3.833分钟， 峰面积2438164微伏·秒。 橙皮素单糖苷，出峰时间4.205分钟， 峰面积1663962微伏·秒。 由图表可得，随着酶水解时间的增加，橙皮苷的含量逐渐减少，橙皮素单糖苷的含量逐渐增多。但是第三个柱形图与应该有的结果相反，可能是由于时间过长，单糖苷分解了依据保留值,主要是保留时间,保留体积 浓度型的检测器，是通过峰高的响应值来定量的；质量型检测器，是通过峰面积来定量的。