将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静 ◆ 实验目的 ● 掌握细胞总蛋白提取技术 ● 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ● 掌握蛋白质转印及抗体染色技术 ● 掌握ECL试剂的使用、X-片曝光及显影方法 实验原理 ● 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 [SDS-olyacrylamide gelelectrophoresis], 对不同分子量的蛋白质进行分离 ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固 相支持物上(PVDF膜 硝酸纤维素膜或尼龙膜上) ● 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印膜 进行反应，使其与膜上的靶蛋白发生特异性结 合. ● 结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗 进行结合; ● 经ECL发光试剂作用、X-光片曝光、显影既可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。 ◆ 实验分为三个部分 ● 细胞总蛋白质的提取及含量测定； ● SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 凝胶转膜及其检测 ? 实验流程 提取细胞总蛋白、测定含量 ↓ 制备SDS胶 ↓ 蛋白样品变性、电泳 ↓ 凝胶转膜 ↓ 封闭(室温1小时) ↓ 一抗反应(4℃过夜) ↓ 二抗反应 (室温、避光50分钟) ↓ ECL试剂作用 ↓ X-光片曝光、显影 ↓ 结果分析 ? 实验方法 　　　 　第一部分 　 细胞总蛋白的提取及含量测定 ◆ 细胞总蛋白裂解液　 　　1 X PBS 　80ml 　　 Tritonx-100 1ml 　　 去氧胆酸钠 0.5g 　 　 SDS 　 0.1g 　　 补1x PBS缓冲液至　　　 100ml PMSF储存液(100mmol/L) ★ PMSF储存液为17.4mg/ml异丙醇 -20℃保存. ? 提取细胞总蛋白 　选取于60mm细胞培养皿中培养的 Hela 细胞(细胞数约为5 X 106/培养皿） ↓ 吸弃细胞培养液，用4℃预冷的1X PBS 洗细胞表面3～4次（－80℃冻存,至少可保存两周) ↓ （ 由－80℃取出冻存细胞）每培养皿加入100ul 蛋白裂解液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面 ↓ 冰浴 40分钟，期间晃动3 ~4次 ↓ 用细胞刮子集中裂解液，收入1.5ml EP 管中， 12,000g 4℃ 离心20min ↓ 　小心吸取上清液并分装 ，-80℃保存 ★ 提取细胞总蛋白注意事项 ● FMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸 　　　入、进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛 　　　或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗. ● PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定, 应在 　　　临用前加入，使终浓度为1 mmol/L ( 1