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酶联免疫吸附试验及其应用 作者：鲍行豪 前 言 近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 二、方法的基本原理和种类 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）ompetition method）oated），也可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。 图1：竟争法测抗原示意图 2、双抗体夹心法 方法的基本原理可用图2来表示 图2.双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。 3、改良双抗体夹心法：本法是双抗体夹心法的一种改良形式，也是用于测定抗原的，其原理可用图3来表示。 图3.改良双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先是将特异性抗体a包被于固相载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b，而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后，再加酶标记抗b抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。 用于测定抗原的尚有第4种叫做抑制性测定法（见图4），它是先用抗原包被固相载体，然后分为二组，一组加入用参考抗体和被检标本混合孵育后的混合溶液，假如标本中不含抗原，则参考抗体未被结合。因此它可以和包被于固相载体上的抗原结合。如标本中含有抗原，则抗原先与参考抗体结合，故参考抗体不再与包被于固相载体上的抗原结合。对加入酶结合物（抗球蛋白）和底物仅显示剩余结合的抗体量。再与另一组不加待检标本的参考系统比较，被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原量成比例，二者之差，即为欲测抗原的量。 图4.抑制性测定法的原理