G0期淋巴细胞暴露于γ射线DNA损伤应答基因转录谱.docVIP

G0期淋巴细胞暴露于γ射线DNA损伤应答基因转录谱 摘要 电离辐射引起人类细胞大量的DNA损伤，这可能改变mRNA表达水平。 我们已经分析了全血中参与G0/G1检查点通路的DNA损伤应答基因的mRNA表达谱，从而评估它们的放射适应性反应，如果有γ射线。血液样本是从25个随机的正常的健康的男性捐赠者收集的，并有书面的知情同意，照射剂量在 0.1 -2.0 Gy (0.7 Gy/min)。利用彗星实验研究DNA链断裂，而用γH2AX作为生物标志物可以将DNA双链断裂可视化。如果存在剂量反应，研究照射后1h和5h所有剂量组的转录水平。在三个不同的吸收剂量(0.1、0.3和0.6 Gy)分别研究转录水平的适应反应，然后是4h后具有挑战性的剂量2.0 Gy。对于两个实验，从照射全血获得的PBMCs分离总的RNA，反转录成 cDNA。用实时定量PCR研究ATM、ATR、GADD45A、 CDKN1A、P53、CDK2、MDM2和Cyclin E 的mRNA表达水平。利用彗星实验观察到尾部DNA损伤百分比以剂量依赖方式显著增加。在γH2AX观察到焦点数量随剂量增加。照射后5h观察到，高达1Gy时，GADD45A、CDKN1A和P53 基因在转录水平上调呈明显的剂量依赖方式(P≤0.05)。在CDK2、Cyclin E和P53观察到mRNA表达水平的放射适应反应，而ATM、ATR、GADD45A、MDM2、ATM和ATR表达谱没有显示任何放射适应性改变。参与G0/G1检查点通路的DNA损伤基因对体内放射敏感性有重要意义，转录表达谱的改变可能对适应反应机制的理解提出新的见解。 关键词 人类外周血单核细胞（PBMC）.mRNA.相对定量.实时定量PCR.γ射线照射 前言 众所周知，包括电离辐射在内的环境诱变因素对人类正常的细胞功能具有极大挑战。电离辐射引起DNA损伤的范围包括单链和双链断裂，DNA交联，人类细胞分离和聚集的DNA损伤。双链断裂（DSB）和聚集的DNA损伤高度有害，有时候DNA错配可能导致染色体异常和基因突变。然而，人类细胞高效的DNA修复机制通过调节各种细胞和分子机制维持基因组的完整性。利用生物标志物监测高水平自然背景辐射暴露的人口总数或个人的职业暴露。例如染色体畸变（尤其是双中心粒）或微核。最近几年，努力建立分子生物标志物去确定辐射特征。利用三种生物标志物的适应性研究可能有助于从电离辐射暴露总人群确定辐射敏感性和辐射抵抗性的个体。 电离辐射的细胞反应是由大量基因介导的，它们控制复杂的调节通路。这些通路可能导致细胞周期延迟、凋亡和DNA修复。电离辐射应答基因表达改变是DNA损伤的指标之一。虽然一些研究这已经研究了对辐射暴露的应答基因DNA损伤的表达模式，但是大部分研究探索不同种类的细胞系，正常人类的成纤维细胞和皮肤活检。 人类外周血单核细胞 (PBMCs)是体外研究理性的选择。很少有关静止淋巴细胞（G0）这些DNA损伤应答基因的转录水平模式。在分裂的细胞，电离辐射诱导DNA损伤，通过运动失调血管扩张调节DNA损伤反应，突变（ATM）和ATR (ATM和Rad3相关的)蛋白激酶属于丝氨酸苏氨酸激酶。ATM/ATR激活后，p53发生磷酸化，其活化诱导GADD45A和CDKN1A (p21)导致G1期阻滞。在这个过程中，参与的其它基因有MDM2、CDK2和Cyclin E，它们可能在G1 期检查点阻滞发挥重要作用。在这篇文章，我们研究静止淋巴细胞这些基因的转录状态。研究的基因的特征如下：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1a (CDKN1A)也被称为 p21，它抑制细胞周期蛋白激酶活性，这是通过p53在转录水平严格调控的。生长阻滞和DNA损伤诱导基因（GADD45A）是GADD家族中电离辐射频繁诱导的唯一成员，它参与DNA修复、染色体完整性的维持、细胞周期调控和凋亡。P53（也称为TP53）调节细胞周期、DNA修复和凋亡。虽然在正常细胞，p53蛋白水平低，但是DNA损伤反应可能增加p53蛋白水平。ATM和ATR是两个信号分子，它们通过含有丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化在DNA损伤位点招募响应电离辐射。细胞周期蛋白依赖性激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶的同分异构体，它通过细胞周期蛋白的帮助调控细胞周期进程。细胞周期蛋白E/CDK2复合体使p27（细胞周期蛋白D的抑制剂）磷酸化，标记它的降解。MDM2 是p53重要的负向调节者。DNA损伤后，紧接着MDM磷酸化导致p53稳定。 这项研究的目的是评估参与G0/G1检查点通路的DNA损伤应答基因的mRNA表达水平是否存在剂量反应。此外，我们试图评估人类血在静止期（G0）对电离辐射反应的这些基因的转录模型是否存在适应反应。针对这些疑问，利用碱性的彗星实验研究PBMCsDNA链断裂的DNA损伤量。由于一些组织蛋白