MTT法与SRB法测IC50的比较.doc

方法 问题 吸光度范围 误差来源 操作 MTT法 0-0.7 MTT还原产物（甲瓒）需被DMSO充分溶解；96孔板靠近边缘的两轮易挥发，测定时间超过24h即舍去这两轮数据（可保证培养箱中一定的湿度） MTT过滤除菌、避光、不可反复冻融，致癌 SRB法 1.5-2.0 非缓冲Tris-base碱液溶解与细胞蛋白结合的染料应迅速，避免动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附 不容易变色，操作繁琐 MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 配制方法 通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配制MTT时用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调pH 7.4 定容1L 注意事项MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的薄膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者可以把操作台上的照明灯关掉. 做MTT测定中,觉得最容易引起误差的一个问题, 是96孔板里溶液在培养过程中容易挥发, 特别是靠近边缘的两轮,在测定时间超过24小时的情况下, 存在明显的挥发现象, 测定数据与中心孔有较大的出入. 所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控制的比较好, 要不就需要弃取周围两轮孔的数据. 另外,有些时候在需要加入不溶性颗粒状药物的情况下测定细胞的增殖情况, MTT法就比传统计数法或台盼蓝法效果好, 测定速度快, 不容易引起误计. MTT的方法不够敏感，而且如果不是贴壁细胞的话，在离心后去除培养基是容易丢失细胞，造成孔间平行度比较差。3H-TdR的敏感度非常好，但是重复性不是特别好，孔间差距比较大，而且不同时间的重复试验时CPM值可以相差比较大。可以通过寻找比较好的细胞浓度，确定掺入时机（细胞处于对数生长期）和掺入时间来弥补。 贴壁细胞1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。另有说法强调加MTT时用无血清培养液（1 MSC 1×105 ,100ul接种96孔板 2 测前4h，更换无血清培养液，同时加入20ul/孔 MTT液（5 mg/ml），37 0c，5%co2，4h 3 吸取上清，加入150 ul DMSO ，震荡15 min 4 37 0c，5%co2，4h（此时间应根据具体的颜色反映来定） 5 490 nm 测OD 值，） 5、终止培养，小心吸去孔内培养液。 6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结