12生物化学实验--核酸的定量分析.docVIP

核酸的定量分析 【 目的 】 1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。 2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。 【 原理 】 核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。 1 ．定糖法 通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。 RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。 DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成 ω- 羟基 γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出 DNA 的含量。 2 ．定磷法 通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。 核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、 α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 660nm 。当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。 3 ．紫外吸收法 核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。核酸在 260nm 的吸光度值与其浓度在一定范围内成正比关系，这是进行定量分析的依据。为了消除样品中核酸以外的小分子物质和核苷、核苷酸或低聚多核苷酸的影响，测定时需加过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂，沉淀除去核酸，测定上清液 260nm 处吸光度值作为对照。将样品的吸光度值减去上清液的吸光度值即为样品核酸的吸光度值。在 260nm 波长下， 1μg/ml 的 DNA 溶液的吸光度为 0.020 ， 1μg/ml 的 RNA 溶液的吸光度为 0.022 ，以此为标准，根据所测得样品的吸光度值即可计算出溶液中核酸的含量。 【 器材 】 1 ．试管和吸量管 2 ．微量移液器 3 ．电炉和烧杯 4. 分光光度计 5 ．离心机和离心管 【 试剂 】 1 ． 5mol/L 硫酸 2 ．过氧化氢 3 ． RNA 标准液（ 40μ ｇ /ml ） 称 RNA40mg ，加 0.1mol/L NaOH 数滴使其溶解，加水到 1 000ml 。 4 ． DNA 标准液（ 400μ ｇ /ml ） 称 DNA40mg ，加 0.1mol/LNaOH 数滴使其溶解，加水到 100ml 。 5 ． 3,5- 二羟甲苯试剂 预先将 3,5- 二羟甲苯在笨中重结晶 1 ～ 2 次，用活性炭脱色，干燥后备用。取 3,5- 二羟甲苯 0.1g ，加浓盐酸 100ml 使溶解，再加入二水合氯化铜（ CuCl 2 ·2H 2 O ） 0.15g 使溶解，混合即可。 6 ．二苯胺试剂 取用 70% 乙醇重结晶的二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰醋酸中，然后再加浓硫酸（保证试剂） 2.75ml 混匀。此二苯胺试剂见光变绿色，需临用前配制，贮于棕色瓶放入冰箱内保存。 7 ．微量定磷试剂 6mol/L 磷酸：蒸馏水： 2.5% 钼酸铵： 10% 抗坏血酸 1 ： 2 ： 1 ： 1 （ V/V ）。此试剂当天配制，应为黄色或浅绿色，如果呈棕色或深黄色则不能使用。 8 ．标准无机磷溶液 用 110 ℃ 恒重的 KH 2 PO 4 配制 100μ ｇ磷 /ml 的贮存液，使用前稀释成 10μ ｇ磷 /ml 。 9 ．过氯酸 - 钼酸铵沉淀剂 70% 过氯酸 14ml ，加钼酸铵 1.0g ，加水 386ml 。 10 ．核酸样品液（ 10mg/ml ） 称粗制核酸样品 1g ，加 0.1mol/LNaOH 数滴使其溶解，加水到 100ml 。或者，取本教材实验十从动物组织中提取出的核酸样品作为本次实验的样品液。 【 操作 】 1 ．定糖法 （ 1 ） RNA 的定量：取三