SouthernBlot原理及实验方法.docVIP

Southern Blot原理及实验方法 原理：?将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。? 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,?如是否有点突变、扩增重排等。?? 试剂和器材 一、试剂 变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。 中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。 20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。 以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。 2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。 6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。 二、器材 22cm×15cm瓷盘 操作方法 1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。 2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转