TUNEL法检测细胞凋亡1.docVIP

TUNE L法检测细胞凋亡 1 原理 TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）是通过检测细胞凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况来评价细胞凋亡的有效方法。细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30﹪的染色体DNA在Ca 2 和Mg2 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体式DNA片段（核小体式剪切）。由于DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3’-OH末端。 增加细胞膜通透性 → 脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）和 荧光素（fluorescein）标记的dUTP进入细胞内 → 在TdT的辅助下dUTP与凋亡细胞中断裂DNA的 3’-OH末端结合 → 再用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗荧光素抗体与dTUT上的荧光素（fluorescein）特异结合（荧光显微镜观察）→ 最后用辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）、过氧化氢与HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色 → 特异准确地定位正在凋亡的细胞 → 普通显微镜下观察和计