WesternBlot蛋白提取与样品制备.docVIP

Western Blot蛋白提取与样品制备 ???? Western Blot第一步便是样品制备，但是在开始制备样品之前，实验者应该对自己的实验有一个非常清晰的思路，通常需要思考的最基本问题包括：要检测的靶蛋白是否存在该样品中？靶蛋白的含量是否在Western Blot的检测下限以上（目前认为Western Blot的有效检测下限为0.1-1ng)？要检测的靶蛋白在组织或细胞的哪个时期存在？是否需要特殊刺激才会表达？是否只有在病变组织中才会有表达？是否存在多种异构体？是否容易发生自行降解？靶蛋白分子量是不是非常大或者非常小？靶蛋白是否仅存在特殊的细胞器中而需要分离出细胞器？充分思考了这些问题才有可能对样品制备有一个比较完善的策略。 ????蛋白提取可以分为三个步骤：第一步获取材料，第二步分离目的细胞或组织成份并破碎，第三步就是进行裂解制样。这里就这三个步骤展开一一讨论。 ????材料的获取???从大方向讲，Western Blot的对象可以是植物组织、动物组织和培养物。植物组织的获取一般应该不是很困难，尤其是可进行人工种植的植物更是方便。动物组织的获取就相对困难许多，一是要考虑到法律上的问题，二是需要实验者有丰富的解剖经验，可以快速准确地从动物体上取下需要的组织或Organ(要和谐，下同)。培养物就不用多说了，几乎每个实验者都养过细菌或者细胞的。如果是动物组织或者植物组织，一般情况