DNA序列多态性.pptVIP

许冰莹, Tel:0871Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院 第六章 DNA序列多态性 第一节DNA序列测定及多态性分析 第二节等位基因特异性探针杂交技术 第三节限制性片段长度多态性 第四节MVR-PCR序列多态性 DNA测序技术发展历史 DNA自动测序 DNA序列分析技术 1.DNA序列测定 2.限制性片段长度多态性 3.序列特异性PCR技术 4.MVR-PCR技术 5.SSCP技术 第一节DNA序列测定及多态性分析 DNA测序(DNA sequencing): 对DNA分子的一级结构的分析 。 经典DNA序列测定技术： Sanger双脱氧核苷酸链终止法 DNA循环测序 一.双脱氧核苷酸链终止法（Sanger ） 1.原理（Principle ） 在DNA合成时，在PCR反应体系中加入双脱氧核苷三 磷酸(2′, 3′- ddNTP),它与dNTP竞争掺入到新生的 DNA链上， ddNTP使链终止。 一.双脱氧核苷酸链终止法（Sanger ） 1.原理： 设置A、C、G、T 4种PCR反应体系，在4种反应体系 中分别加入ddATP、ddCTP、 ddGTP、 ddTTP,其他试剂 相同，在Taq DNA聚合酶作用下，生成具有相同的5′ 末端，而3′末端不同的DNA片段的混合物,经电泳分 离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。 3.Sanger双脱氧链终止法基本方法 （Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method）  （1）准备DNA模板 单链DNA和碱变性的双链DNA。 （2）dNTP标记物 32p,生物素，碱性磷酸酶 （3）DNA聚合酶 DNA聚合酶Klenow片段，5’ 3’聚合酶活性和 3’ 5’ 外切酶活性，校正引物3’端错配碱基。 3.Sanger双脱氧链终止法基本方法 （Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method） （4）测序反应设置4个反应管A、C、G、T： A管：dNTP+ddATP C管：dNTP+ddCTP + G管：dNTP+ddGTP T管：dNTP+ddTTP 3.Sanger双脱氧链终止法基本方法（Basic method of Sanger Dideoxy chain termination method） （5）反应循环条件 55 ℃ 30min,放室温使模板与引物退火并延伸 （6）聚丙烯酰胺凝胶电泳 8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（8mol/L尿素），4个反 应管产物分别在比邻的4个点样槽加样。 （7）显带，从电泳谱带读出DNA序列。 二.PCR循环测序技术（PCR cycle sequencing technology） 以双脱氧链终止法为基础的标准DNA测序方法。 采用热循环高效合成DNA，并结合双脱氧链 终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循 环中增加，称为循环测序。 二.PCR循环测序技术（PCR cycle sequencing technology） 2.DNA自动测序技术的基本步骤 制备测序模板-PCR反应 测序模板的纯化与定量 测序反应--PCR仪（94 ℃ ，1min；60 ℃ ,30s；72 ℃ ,30s；20-40循环） 测序反应产物纯化与变性 上样电泳--测序仪 分析结果 四色荧光染料(BigDye)标记终止物 测序反应体系和条件（Sequencing reaction system and condition） 测序反应（ Sequencing reaction ） 电泳检测（Electrophoresisdetection） —3130型遗传分析仪 荧光检测（Fluorescence detection） DNA自动测序结果（Automatic DNA sequencing results） 3.DNA自动测序技术的特点（ characteristics of Automatic DNA sequencing technology ） 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h 三种测序方法的比较 第二节等位基因特异性探针杂交技术 （ allele specific oligonucleotide ，ASO） 一.概述 1.等位基因特异性寡核苷酸探针 根据等位基因的序列差异，设计并合成针对 不同等位基因的DNA探针。 一.概述 2.杂交