三种酶活性测定.docVIP

水体中碱性磷酸酶活性：对硝基苯磷酸二钠(p—NpP，sigma公司)，本实验中所选择的反应条件为：pH8.4(用Tris缓冲溶液调)、温度30℃、反应物体积5mL、反应时间6h、波长4l0nm，岛津uv-2401分光光度计测定． A 总的 0.45um 膜 藻类 0.2um 细菌 溶解性的物质 Berman T Alkaline phosphatases and phosphorus availability in Lake Kinneret 1970 .洪华生 海水中碱性磷酸酶活力的测定及其在磷循环中的作用初探 1992(04) 12.Chrost R J.Overback J. Kinetics of alkaline phosphatase acitivity and phosphorus availability for phytoplankton and bacterioplankton in lake Plu β see (North German Eutrophic lake) 1987(13) 底泥中碱性磷酸酶(APA)测定方法 AP(磷酸酶) 催化无色底物0.1 % p-对硝基苯磷酸二钠(p-NPP) 产生稳定的黄色产物P-NP, 在410 nm可见光下,通过测定P-NP的产生速率,即可换算出AP活性APA. 1. 试剂 1. NaOH: 4g NaOH溶于100mL H2O中 对硝基苯磷酸二钠(p-NPP) : 6.75g p-NPP 溶于水中, 并稀释至1000ml.(1ml含25mg酚) 2. 底物混合液： 1ml p-NPP百倍母液+99ml tris-HCl 3. Tris-HCl缓冲溶液: 1g Tris中加入2.061ml 浓HCl,用水定容至1000mL,溶液的pH为8.5 4. 对硝基苯酚储备液(1g/L): 1g对硝基苯酚溶于蒸馏水中并稀释至1000ml,溶液保存在暗色瓶中. 2. 标线制备 (辛承友 2004) 对硝基苯酚使用液(10mg/L即1ml含10ug酚): 10ml对硝基苯酚储备液用缓冲液稀释定容到1000ml容量瓶中 分别取0,1,2,3,4,5ml 对硝基苯酚使用液于10ml EP管内，分别加缓冲液5,4,3,2,1,0ml(对硝基苯酚浓度分别为0,2,4,6,8,10mg/L) 加入0.5ml NaOH 离心5000转,10min 离心后取上清, 以水为参比,410nm比色 3. 实验组 A. 向EP管内加入0.1g sediment (2ml water) B. 加底物混合液5ml C. 30oC 6h(摇床上振荡恒温培养) D. 加NaOH 0.5ml, 离心5000转,10min E. 以水为参比,410nm测吸光度 4. 对照组 A. 向EP管内加入0.1g sediment B. 加NaOH 0.5ml，加底物混合液5ml C. 30oC 6h(摇床上振荡恒温培养) D. 离心5000转，10min E. 以水为参比,410nm测吸光度 对照组和实验组同时进行,标线制备一次即可 底泥或水样零下20度保存底泥中脱氢酶(DHA)测定 采用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物 (2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)为基质经脱氢酶催化还原反应后生成红色产物(TTCH2-trifenylformazane，TpF)，丙酮萃取。采用分光光度计于485nm波长处测定其吸光值，根据标线计算出TpF生成量来表示DHA。 依次加人Tris-HCl缓冲溶液1.5 mL、0.l mol/L葡萄糖溶液、0.4 % TTC溶液和0.36 % Na2SO3溶液各0.5 mL，置于37 ℃恒温水浴振荡仪中培养2 h后取出，加人0.5 mL甲醛终止反应，准确加人5 mL丙酮，37 ℃振荡萃取10 min，在3000 r/min的条件下离心5 min，492 nm处测定吸光度。在上述条件下，l h产生1 μg TF的量为一个酶活力单位。 底泥预处理：取底泥 0.2g sediment于EP管中，用蒸馏水振荡混合后，5000 r/min离心5 min，弃去上清液，如上方法洗涤三次 试剂 0.36%硫酸钠溶液: 0.36g硫酸钠用水定容至1000ml TF储备液：称取30mgTF用定溶于50mL棕色容量瓶中，此溶液即为l g/L TF的标准溶液 2. Tris-HCl缓冲液(pH＝8.4)： 称取6.037g Tris，加入20mL 1mol/L HCl, 再定容至1000mL 3. 甲醛 4. 丙酮 5. 0.4%TTC溶液: 取0.4gTTC溶于Tris-HCl缓冲液定容至10