ZBL-生物化学第五章蛋白质化学5-13节.ppt

测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大于97％）而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是： 拆开肽链内部的二硫键。（β-巯基乙醇、二硫苏糖醇） 2. 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。 3. 将每条肽链分开，并分离提纯。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链。 4. 肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。 5. 肽链的另一部分样品进行末端鉴定。（二硝基氟苯法（FDNB）测N端；肼解法测C端。） 6. 肽链降解成一套大小不等的肽段，将各个肽段分离并测序。 7. 再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段。 8. 用Edman降解等方法测定各肽段氨基酸顺序，比较两套肽段的氨基酸顺序，利用不同肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。 9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。 1. 末端分析 （1）N末端测定 ① 二硝基氟苯(DNFB)法Sanger法 DNFB在弱碱性溶液中与肽链末端自由氨基反应，生成黄色的二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质），酸水解后生成DNP-AA和其它氨基酸混合物，再用色谱分析鉴定氨基酸种类。 ② 丹磺酰氯法比DNFB法灵敏100倍。 丹磺酰氯是一种强荧光剂，可用于测定肽链的氨基末端，它能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的