第三节核酸的分子杂交.pptVIP

影响杂交的因素 核酸分子的浓度 浓度大，复性快 长度 分子量大，复性慢 温度 离子强度 核酸分子的复杂性 二、核酸探针及标记 定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。 制备特异性探针所需要的基本条件 1.被检基因结构清楚； 2.有明确的基因产物; 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。 探针所携带的标记物应具备的条件： 标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。 标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 稳定性好、环境污染少、价廉。 常用的探针标记物： 放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等。 非放射性同位素： 地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 三、分子杂交的应用 Southern 印迹法 Northern 印迹 Western 印迹法 原位杂交 生物芯片 Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 预杂交 为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。 常用于预杂交的封闭物： 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 Southern Blots: Identifying Specific DNA Fragments Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 原位杂交(in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 Western 杂交印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜 靶蛋白的免疫学检测 DNA芯片技术的概念 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。 生物芯片 基因芯片 蛋白质芯片 细胞芯片 组织芯片 第四节 RNAi 一、 RNAi的发现及作用方式 二、 RNAi的应用 RNA干扰 一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达,促使ｍRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference, RNAi,也译作RNA干预或者干涉)。 RNA干扰现象的发现 线虫中首次发现了RNAi ： 首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis.elegans)的研究。1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA (antisense RNA)去阻断par1基因的表达以探讨该基因的功能,结果反义RNA的确能够阻断基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA(sense RNA)作为对照,也同样阻断了基因的表达。 ＧｕｏＳ,ＫｅｍｐｈｕｅｓＫＪ.ＰａｒＬ.[Ｊ].Ｃｅｌｌ, 19