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基于银纳米粒子构建荧光传感平台用于核酸检测 张瑛洧1 李海龙1,2 孙旭平1* 1（中国科学院长春应用化学研究所，） 2（中国科学院， 100039） 摘　要　DNA探针被吸附到银纳米粒子的表面，荧光团由于和银纳米粒子近距离接触而发生荧光淬灭，接下来加入同探针DNA序列互补的目标DNA，两者杂交形成双链DNA后从银纳米粒子的表面脱离下来，从而荧光得到恢复。这种银纳米粒子构建的荧光传感平台对于完全互补和碱基错配的DNA序列具有良好的区分能力。 关键词　；； 1 引 言 DNA 分子中碱基序列的突变有关，因此，发展迅速、有效、灵敏和低成本的核酸检测方法对于研究基因的表达、临床疾病的诊断和治疗都有着重要的意义[1]。随着纳米结构的日益发展，其在生物技术体系的诊断应用引起了人们广泛的关注，并且已有一些成功应用的例子[2,3]。据此，研究人员将纳米结构引入到荧光核酸检测中并做了许多工作，其机理主要是基于荧光共振能量转移或淬灭机理[4]。已证实纳米结构在这种检测体系中扮演的是“纳米淬灭剂”的角色，并且一种纳米结构可同时淬灭不同发射波长的多种染料。应用纳米结构做淬灭剂，消除了以前检测方法中要挑选荧光团-淬灭剂对的麻烦。目前，已报道的被成功地应用于荧光核酸检测的纳米结构有以下这些，比如：金纳米粒子、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纳米粒子、介孔碳微粒、氧化石墨、聚对苯二胺纳米带、配位聚合物胶体球等[4-28]。尽管如此，继续发展新材料的纳米结构来构建荧光检测平台以提高荧光核酸检测的选择性和灵敏度等仍然很有必要。 在本文中，经实验证实，银纳米粒子也可以作为淬灭剂来构建一个新的荧光传感平台用于核酸检测，其展示了很高的选择性，可实现对完全互补和单碱基错配DNA序列的区分，其中单碱基、两个碱基错配的目标所引起的荧光恢复是完全互补目标引起荧光恢复的83%和60%。此外该平台的检测灵敏度很高，检测限可低至5 nM。如图1所示，检测的设计策略如下：荧光团标记的单链DNA探针被吸附到银纳米粒子的表面引起荧光淬灭，之后与目标DNA杂交得到双链DNA，其从银纳米粒子的表面脱离使得荧光得到恢复。这种设计主要是基于单双链DNA在银纳米粒子表面有不同的吸附能力[7]。 图 1 使用银纳米粒子构建荧光传感平台进行荧光增强核酸检测的原理图。 Fig. 1. A schematic diagram (not to scale) to illustrate the fluorescence-enhanced nucleic acid detection using Ag nanoparticle as a sensing platform. 2　实验部分 2.1仪器与试剂 H-8100型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）上获得，加速电压为200 kV。荧光光谱测定在RF-5301PC（日本Shimadzu公司）荧光分光光度计上海生工生物工程技术服务有限公司Milli-Q高纯水处理系统纯化。本实验所采用的DNA 序列如下（错配位置由下划线标出）： PHIV (荧光素FAM染料标记的作为探针的单链DNA): 5’-FAM-AGT CAG TGT GGA AAA TCT CTA GC-3’ T1 (互补的目标ＤＮＡ): 5’-GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CT-3’ T2 (单碱基错配的目标ＤＮＡ): 5’-GCT AGA GAT TGT CCA CAC TGA CT-3’ T3 (两个碱基错配的目标ＤＮＡ): 5’-GCT AGA GAT TGT ACA CAC TGA CT-3’ 2.2 实验方法 AgNO3用500 mL水溶解，加入10 mL（1%）的柠檬酸钠水溶液，在90 ℃加热半小时，得到黄色的胶体溶液[8]，待进一步的表征和应用。 结果与讨论.1 电镜表征 图2给出的是银产物的透射电镜照片。低倍照片显示产物完全是大量的纳米粒子，高倍照片显示粒子尺寸在50-100 nm的范围。 图2产物的（ａ）低倍 和（ｂ）高倍的透射电镜照片。 Fig. 2 (a) Low and (b) high magnification TEM images of the products thus formed. 3.2 荧光检测 应用所制备的银纳米粒子（AgNPs）构建荧光传感平台进行核酸检测，并采用与人类免疫缺陷病毒(HIV)相关联的DNA序列构建模型体系。图3显示的是荧光团FAM标记的单链DNA探针（PHIV）在不同条件下的荧光发射谱。如曲线a所示，当体系中没有银纳米粒子存在时，由于荧光素染料的修饰，探针DNA展示了很强的荧光发射。然而当加入银纳米粒子进入检测体系超过３０分钟时，根据曲线