北医分子生物复学习思考题.docVIP

如何设计DNA序列的引物（尤其为方向） （1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低， 过长时则成本增加，且也会降低特异性。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应 有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。 （5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而不选A. (6) 引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制， 只要与 模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不 与模板DNA匹配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造成突变。 二、 如何提高PCR 扩增特异性 1. 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续在扩增中占据优势。 2. 热启动 （1）热启动PCR 是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一。（尽管TaqDNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成，直到PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。）热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 （2）抗体的应用。Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制，以至于在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。（将与TaqDNA 聚合酶特异性结合的抗体加入反应溶液中，抗体与TaqDNA 聚合酶结合，使TaqDNA 聚合酶不具有活性。当反应体系加热时，抗体与TaqDNA 聚合酶分开，从而使TaqDNA 聚合酶发挥作用。PCR反应开始进行。） 3. 促进PCR 的添加剂 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC 含量，长DNA的模板，需要其他的措施。影响DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。PCR 添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution 还有其他优点。在同PlatinumTaq DNA 聚合酶和Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum 技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。 4. 巢式PCR 使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循