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超薄切片技术 河北大学细胞生物学 由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。  超薄切片主要步骤 取材、分割 固定 脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染色 1 取材、分割 1.1 取材、分割的基本要求 ? ? 组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷。 (1)动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。(2)体积要小，一般不超过0.5mm×0.5mm×0.5mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。 (3)机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。 (4)操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。 (5)取材部位要准确。 ? 1.2 取材方法： 将取出的组织放在洁净的韧性较大的纸上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。 2 固定 2.1?固定的目的 是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。 2.2 固定的方法 有物理法和化学法两大类。 物理法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结构； 化学法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。现通常使用化学法对组织或细胞进行固定。 2.3常用固定剂有: (1)四氧化锇 (OsO4) 是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为1-2小时。 (2)戊二醛 ( ?C5H8O2) 戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。? 组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定法。分前固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定1～ 2小时，pH7.2～7.4。固定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水 。 3 脱水 为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。 急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱水应梯度进行： 15% 乙醇15分钟，30%乙醇15分钟，50%乙醇15分钟， 70% 乙醇15分钟，85%乙醇15分钟，95%乙醇15分钟，100%乙醇１0分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难。 4 渗透和包埋 4.1渗透? ? 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。 目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy ?resin)。环氧树脂是一类高分子聚合物，它的分子中含有两种反应基团，即环氧基和羟基。当加入酸酐类时，树脂分子中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接，这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂，它们参与交联反应，并被吸收到树脂链中。常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。 当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂