3-转录及其调控辩析.ppt

亮氨酸拉链结构常出现于真核生物DNA结合蛋白的C-端，它们往往是和癌基因表达调控功能有关。 这类蛋白质的主要代表为酵母的转录激活因子GCN4，癌蛋白Jun，Fos，Myc，增强子结合蛋白C/EBP等。 这类基元结构是解决基因转录调控的途径之一 RNA的加工、成熟。 阻遏蛋白的负性调节 ： 在缺乏诱导物（乳糖）时，这些基因不能转录，因为阻遏蛋白是活性状态结合在操纵基因上。 lac阻遏物（lac repressor）由　lac I产生，其功能是和lacZ、Y、A基因簇5′端的操纵基因（lac O）,操纵基因位于启动子(lac P)和结构基因（lac ZYA）之间。 在此系统中的诱导物并非乳糖本身,而是乳糖的同素异形体,称为异乳糖(allolactose)。乳糖进入E.coli细胞,被转化成异乳糖。异乳糖与阻遏蛋白结合后,它们即从操纵基因上解离下来,lac操纵子基因即开始表达。 β半乳糖苷酶的浓度可以增加1000倍之多。 一个诱导物分子结合在阻遏蛋白的特异部位上,引起阻遏蛋白构象的改变,结果使阻遏蛋白从操纵基因上解离下来。 有乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合使R构象变化，R四聚体解聚而与O解离。 特殊底物的存在导致了酶的合成，此现象称为诱导（induction）。这种类型的调控广泛存在于细菌中，在较低等的真核生物（如酶母）也有这种情况。 　当E.coli生长在缺乏β一半乳糖苷的条件下是不需要β-半乳糖苷酶的，因此细胞中含量很低，大约每个细胞不高于5个分子，当加入底物后细菌中十分迅速地合成了这种酶，仅在2-3分钟之内酶就可以产生并很快增长到5000个分子/每个细胞。如在酶的浓度将达到细胞总蛋白的5-10%。如在培养基中除去底物，那么酶的合成也就迅速停止，恢复到原来的状态。 负反馈：细胞质中有了β—半乳糖苷酶后，便催化分解乳糖为半乳糖和葡萄糖。乳糖被分解后，又造成了阻遏蛋白与操纵基因结合，使结构基因关闭。 一些乳糖类似物不能被β-半乳糖苷酶分解，却也能与R特异性结合而使其构象改变，诱导1ac操纵子的开放。 如异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside, IPTG)是很强的非代谢性诱导剂；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一种人工合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应用在分子生物学和基因工程工作中。 蓝白斑筛选--- α-互补 载体 载体： 带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和其前146个氨基酸的编码信息。 宿主细胞：编码β-半乳糖苷酶C端部分序列 载体+宿主细胞→完整的lacZ基因及调控序列 β-半乳糖苷酶 称为α-互补 由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。 然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 CAP-分解（代谢）物基因结合蛋白 CAP的正性调节作用 1ac操纵子的强诱导既要有乳糖又要无葡萄糖。 乳糖操纵子属于可诱导操纵子(inducible operon)，在缺乏诱导物时，这类操纵子只有本底水平的表达，约为诱导时表达水平的0.1%左右，lac操纵子的表达水平在诱导和阻遏之间的差别在103倍。 色氨酸操纵子(tryptophane operon)代表了一种衰减调控模式。 Trp是构成蛋白质的组分，当有足够的Trp时，操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。 缺乏Trp时，Trp操纵子被打开，5个结构基因表达，产生3个酶催化分支酸合成为Trp。 1.负调控 合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群；受其上游的启动子P和操纵子O的调控。 调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表达调控蛋白R’。 R’并无活性，当提供足够的Trp时，Trp与R’结合使其构象改变而成为活性形式R，R可与O特异性结合，阻遏结构基因的转录，R的阻遏能力仅为lac I产物的1/1000。 当Trp达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生Trp合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与Trp浓度呈负相关。这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关。 前导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA，它编码了一个14