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内生真菌混合培养及其抗菌活性的初步研究 杨民和 苏经迁 （福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350108） 侵染茶树致病的病原微生物主要是病原真菌。目前世界上已记载的茶树病害有500多 种我国有138种，其中真菌病害72种，线虫病害9种，寄生性显花植物园16种，其它病 原（类菌原体、细菌和类细菌）病害4种，地衣、苔藓25种，藻类24种，非侵染性10种。针对茶树病原菌，目前世界范围内主要使用化学农药来防治，但是化学农药的长期使用带来了许多问题 ,如昆虫产生抗药性并导致农药使用剂量的不断加大 ,在粮食、水果、蔬菜中产生残留 ,由于生物富集作用而使以这些农作物为食物的野生和家养动物的残毒加大。因此 ,一些国家很早就已经开始研制一系列选择性强、效率高、成本低、不污染环境和对人畜无害的生物农药[1]。 生物农药如植物内生菌生产的抗菌剂、抗虫剂及生长素对植物病害起到了很好的防治及促生作用。这样既减少了化学农药对环境的影响、又保证了农产品的品质。所以植物内生真菌的代谢物有的被开发为农作物上用于抗虫的药物的潜力，这可能是更安全、更环保的治疗农作物病虫害的潜在的生物资源库[2] 目前，关于茶树内生真菌的研究工件集中在：（1）针对单一菌株的分离、鉴定和培养；（2）侧重单一菌株所产抗菌物质的分离、纯化和结构鉴定。如果把植物内生真菌群理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏在内的病原微生物。如果将单一菌株分离出来进行培养，可能会由于缺乏其它与之相互作用的微生物的刺激作用而使该单一菌株的代谢活性下降，抗菌物质产量降低，甚至无法产生孢子。 人类对微生物的利用，经历过天然混台培养到纯种培养两个阶段，分离纯培养技术的发明和应用是微生物学发展的一个巨大进步，但是在长期的实验和生产实践中，人们也不断地发现很多生物过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行，必须依靠两种或两种以上的微 生物共同培养完成[3]。研究表明：混合培养时各菌之间可能进直接或间接地相互作用 ，互相提供所需的营养，转移或消除抑制产物，或通过一些物理或生化机制刺激彼此间的生理活性 [4] 。随着内生菌纯培养技术的完善和对内生菌间互生和共生现象的研究，进行人工的混合菌培养，力求在人工控制的条件下重现几种内生菌在茶树中的相互关系，进而获取所需的抗菌物质已渐为人们所重视。对混合菌资源的研究不仅具有深远的理论意义，更具有重大的应用价值。 材料与方法 材料 1.1.1 菌株来源 从采自江西庐山植物园、福建省泉州市安溪县茶园、福建农林大学茶园的茶树上分离到内生真菌。分离方法：取健康茶树的叶、茎和根部先用自来水将新鲜植物组织表面冲洗干净，自然晾干后将茎和根切成1cm左右的小段，用75％酒精漂洗1min，无菌水冲洗3～4次，又用3％次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗3～4次，每次2min，取最后1次无菌水洗液涂于平板上，在恒温培养箱中28℃培养3～4d，若发现皿中无菌落生成，则证明该材料表面消毒彻底，否则，不能使用。将上述处理过的茶树材料接种到PDA固体培养基置于28℃温箱培养5～7d，待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分至试管斜面上，置于28℃温箱继续培养。 1.1.2 测试用的病原菌的来源 2007年4－5月份从福建农林大学茶园采集出现病害症状的茶叶，进行茶树病原菌的分离、鉴定，并获得多毛孢（茶轮斑病）、黑腐菌（茶云纹叶枯病）的纯培养。分离方法：选择典型病斑的茶树叶片，切下病健交界处组织0.5cm×0.5cm的长段（片），将组织块先用70%酒精浸5-6秒，后再用0.1％升汞浸泡１分钟,无菌水洗３次，每次４～５min；组织块在无菌培养皿中适当晾干后，用无菌镊子（在火焰上烧）移到平板培养基上，在28℃恒温下培养． 1.1.3 培养基 PDA培养基（马铃薯琼脂蔗糖培养基）、PD培养基（马铃薯蔗糖培养基）。 1.2 方法 1.2.1 实验用菌的选择 在内生菌的分离过程中，根据各种菌内PDA平皿上菌落分布及数量，从中筛选出实验用菌，作为混合培养筛选的菌种。 1.2.2 各菌之间相互关系的初步确定 采用两点对峙培养法，对4种菌进行活化后，切取培养6天同质量的内生真菌的菌丝块接种于PDA平板上距中心2cm处同一直线的两点上，同时设接单种菌为对照，每个处理3个重复，于28℃恒温培养，并观察两菌之间的相互关系。同时对能相互混合生长或部分混合生长的用扦片法将盖玻片插入两菌之间的边缘处，并在显微镜下观察，做进一步确认[5～7]。 1.2.3 发酵过程及发酵液的处理方法 由对峙培养法确定的两株木霉以1:1的接种量，用0.5cm的打孔器从平板上各取1块同时接种到发酵培养基摇瓶发酵。三角瓶的装液量为总容积的2/5，即250ml三角瓶中装100ml发酵培养基，