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分子植物病理学实验报告 姓名: 专业: 植物病理 学号: 实验一 水稻总DNA的提取 实验目的 通过水稻叶片DNA的提取,掌握提取植物DNA的原理和方法 实验原理 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB), 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA释放出来。再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 实验材料及仪器 材料:水稻叶片（一般把种子放到培养皿中，让它长到三叶一心时即可，当然也可以从田间采集嫩的水稻叶片来提取DNA） 实验方法: CTAB法 试剂: 液氮，CTAB提取液, 氯仿/异戊醇（24：1）,冰乙醇, 70%乙醇, 超纯水 仪器:台式离心机,水浴锅,移液枪,枪头, 1.5mL或2mL离心管 实验步骤 本实验用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下： 将洗净的培养皿内垫上一层滤纸，将水稻种子置于滤纸上，用脱脂棉固定种子，加水保湿，将其移至光照培养箱（28℃，湿度90%，光照12小时）。一周后即可发芽，发芽后移栽到土里，待幼苗长至三叶一心期时，即可作为提取DNA的材料。 取三叶一心的水稻幼苗一株，将其剪碎后置于研钵中加液氮研磨成粉末状，移至已灭菌的2.0mL离心管，一般加到离心管的1/3体积。 在离心管中加入已在65℃预热的600μL2%CTAB提取液（0.1M Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），8%NaCl，2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）），也可根据样品量适当增加提取液的量，上下颠倒混匀，置于65℃水浴锅保温30min-1h。 将样品从水浴锅中取出，加入与提取液等体积600μL的氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒离心管使之充分混匀，12,000rpm离心15min。 吸取上清液500μL置于已灭菌的1.5mL离心管，再加入等体积500μL的氯仿/异戊醇（24：1），上下颠倒离心管使之充分混匀，12,000rpm离心15min。 吸取上清液450μL置于已灭菌的1.5mL离心管，加入同体积450μL在-20℃预冷的冰乙醇，轻轻颠倒离心管使之混匀，置于-20℃冰箱，放置2h以上，沉淀DNA。 10,000rpm离心10min，倒去上清液，保留沉淀。质量好的DNA应为无色透明胶状物体。 加入400μL70%乙醇漂洗两次除去杂质，10,000rpm离心5min，收集沉淀。置于无菌工作台风干，直到管底无水珠，此时DNA应为肉眼不可见。 加入100μLTE缓冲液（10mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA（pH8.0））或灭菌超纯水溶解DNA。 最后将提好的水稻DNA放-20℃冰箱保存备用 注意事项 提取DNA时材料应选择幼嫩叶片,因为嫩叶中DNA含量高老叶片含很多色素，糖等成分，会对DNA的质量有影响。 叶片磨得尽可能细，一般磨成粉状即可。根据本人经验叶片的粗细对DNA 质量没有多大影响;关键是磨好的叶片粉状加到离心管里，不能加得太多，其次是CTAB的量要够（依据水稻叶片粉末的量而定）。 为了得到质量较好的DNA或减少蛋白质的的量，应该用氯仿/异戊醇多抽提几次，对于老叶片一般至少要抽提3次。当然，有条件的话，最好再用酚抽提一次，以除去蛋白质，甚至可以加入RNase去除RNA，这样电泳出来的DNA才会没有蛋白质和RNA。 实验二 水稻基因组DNA浓度检测 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 实验原理溴化乙锭或花青素可以插入到DNA配对的两碱基之间，当在紫外灯照射下会激发荧光，从而可以看到DNA条带.（由于溴化乙锭有毒，所以本实验用花青素）；由于DNA含有磷酸基故带负电，在电泳过程中会向正极迁移。迁移率与它的电荷数和分子量有关，分子量越大，迁移率越小。 实验材料及仪器 实验方法: 采用花青素或溴化乙锭荧光染色法检测基因组DNA浓度 试剂: 上样缓冲液Loading buffer/花青素(39/1),0.5TBE, 1%琼脂糖 仪器: 电泳仪 实验步骤本 取2μLDNA样品与2μL上样缓冲液loading buffer（98%甲酰胺、10mM EDTA、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青）（添加花青素，比例为39：1）混合，将样品加入到0.8%琼脂糖凝胶胶孔中，同时配置已知量的标准DNA（λDNA）溶液（分别为：25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL 200ng/μL）作为对照。200V电泳