分子试验思路及方法.docVIP

整体试验思路： 具体实验方法： RNA提取方法： Unizol 法： 0.1g样品加1ml 提取缓冲液（Unizol），摇晃，放到冰里。 匀浆：匀浆器用之前要先用DEPC水清洗，再用无水乙醇清洗。 分别取匀浆液到新管中，盖好，做好标记。12000g 2~8℃ 离心10min。 取上清液到另一个离心管中，室温静置5min。 按每ml提取液加入200ul氯仿（三氯甲烷）。剧烈震荡15秒，室温静置2-5min. 12000g 2~8℃ 离心15min。 取上清，按每ml提取液加入500ul异丙醇，混匀。-20℃ 静置2h。 12000g 2~8℃ 离心10min。 去掉上清，加入75%酒精 1ml（该酒精要用DEPC水稀释），7000g 离心 7min。 去掉上清，干燥。 加入20ul或30ul DEPC水溶解。 取5ul电泳检测，1ul测定浓度及纯度，其余的-80度冰箱保存或直接反转录。 Aidlab RNA提取试剂盒：（快速、效果好些） 匀浆：组织20mg 加350ul，组织20~30mg 加600ul 裂解液RLTplus，电动匀浆20~40秒。 将匀浆后裂解物13000rpm 离心3min，将上清液全部加到DNA清除柱上。 立刻13000rpm离心60秒，保留过滤液。（确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留） 用移液枪精确估计滤液体积，加入一般体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。 立即将混合物（每次小于700ul，多余的可分为两次）加入一个吸附柱RA中，13000rpm 离心30秒，弃掉废液。 加700ul 去蛋白液 RW1，室温放置1min，12000rpm 离心30秒，弃掉废液。 加500ul 漂洗液RW，12000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500ul漂洗液RW重复一遍。 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm 离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 取出吸附柱RA，放入一个RNase free 离心管中，在吸附膜的中间部位加30~50ul RNase free water，室温放置1min，12000rpm 离心1min。 若想使RNA浓度高，可将第一次的洗脱液加回柱子，重复一遍。 反转录： Takara 公司反转录试剂盒： 5×PrimeScript Buffer 2ul PrimeScript RT Enzyme Mix1 0.5ul Oligo dT Primer 0.5ul Random 6 mers 0.5ul Total RNA 按说明书要求浓度添加 RNase Free dH2O 加水补齐至总体积为10ul （注：可成倍扩大体系） 反应条件： 37℃ 15min 85℃ 5 sec PCR PCR反应体系： H2O 11.6ul dNTP mixture 3.2ul PCR buffer 2ul cDNA 1ul 正向引物 1ul 反向引物 1ul Taq 酶 0.2ul 共：20ul PCR反应条件： 1． 94℃ 4min 2． 94℃ 30sec 3． 52℃ 45sec （该步退火温度可变） 4． 72℃ 1min 5． Go to 2 cycles 29 6． 72℃ 10min 7． 4℃ forever （四）实时荧光定量PCR： Takara 公司 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒： 内参基因：一般为β-actin。目的基因与内参基因各做3个平行。 引物设计要求： PCR扩增产物长度：80~150bp最为合适（可延长至300bp） 引物长度：17~25 mers GC含量：40~60% （45~55%最佳） Tm值：正反向引物Tm值不能相差太大 OLIGO：63~68℃ Primer 3：60~65℃ 引物序列： A、G、C、T整体分布尽量