初稿赤水河流域茅台段土壤宏基因组的提取及检测.docVIP

赤水河茅台段土壤微生物宏基因组的提取 张世冲 摘 要：赤水河其独特的水质、土壤、气候等自然环境，造就了经典国酒茅台，从赤水河茅台段采集土壤，提取土壤微生物宏基因组，再进行扩增测序，为分析该地区土壤微生物种群结构和筛选出相关的功能基因奠定基础。 关键词：赤水河茅台段；土壤微生物；宏基因组 迄今,不可培养微生物占据微生物总数的90%以上 [1] , 这使得土壤微生物分子生态学研究受到限制。自然条件下包括病毒在内的微生物通过群落广泛参与CNO和S等重要元素的循环转化在人体的食物消化毒素降解及机体免疫反应环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2],微生物主要是通过其群落而非单一个体来执行这些重要功能，而目前人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种，对微生物群落作为整体的功能的认识远远落后于对其个体的认识,因此，自1991年Pace首次提出环境基因组学的概念并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库以来，有关宏基因组学的研究受到广泛关注[3]。宏基因是指在某一时刻某一生活区内所有微生物基因组的总和。利用分子生物学方法从土壤中提取宏基因组, 可用于分析这些不可培养的微生物,可用于从土壤中分离以前所不能得到的新型微生物的基因 ,也可用于分析土壤中微生物的种群多样性和动态变化 [4] 。赤水河是贵州省仁怀市的母亲河、英雄河和美酒河［5］。茅台酒生态功能保护区位于茅台酒厂上游赤水河河谷地带，地处北纬27．782 20°一27．855 8°，东经106．275 8°一106．365 6°，海拔407m—781 m，夏季平均气温约28℃［6］。茅台镇四面环山，地势低洼，气候炎热，具有独特的微生物群，因与外界的空气对流循环较缓慢，故微生物种群较稳定。茅台酒的生产用水取自于赤水河，其水质、土壤、小气候环境以及其微生物种群，是酿造茅台酒的重要因素。水的质量直接影响酒的好坏，而土壤又与水质有着极其紧密的联系，本文拟通过对该地区土壤微物赤水河茅台段土壤微生物宏基因的研究来为分析该地区土壤微生物种群结构和筛选出相关的功能基因奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集 本实验所用的土壤样品取自于赤水河流域。 1.1.2 酶和试剂 E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司，其他试剂均为国产分析纯，PCR引物由上海生工合成。 1.1.3主要仪器　 PCR仪为S1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad）,WD-9413A凝胶成像分析仪（北京六一）、EM-259EB1微波炉（三洋）、Miro17R Centrifuge离心机（Thermo Scientific）。 1.2 方法 1.2.1 土壤微生物DNA的提取与纯化 按照OMEGA Bio-Tek公司E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒说明略作修改进行提取。称取500㎎ Glass Beads加到1.5 ml的离心管中，再称取0.5g的实验土壤样品，经过充分研磨后转移至离心管中，然后向管中添加1ml的Buffer SLX Mlus,涡旋震荡3min,再向离心管中加入100μl Buffer DS,涡旋2min。将离心管放在温度为90℃的水浴锅中10min，水浴完后，室温3000r/min离心3min，收集上清液800μl至新的2ml的离心管中，再向其中添加270μl Buffer SP2，涡旋1min，然后在冰上孵育5min，孵育完后，在4℃下13000r/min离心5min，吸取上清液转移至新的2ml离心管中，然后加0.7倍上清液的冷异丙醇，混匀，放入-20℃冰箱中孵育1h，然后在4℃下13000r/min离心10min，小心倒掉上清液，将离心管倒置在吸水纸上1min。加200μl Elution Buffer（提前放在70℃水浴锅中水浴）到管中涡旋10s，70℃下水浴15min，加50μl HTR Reagent涡旋10s，室温放置2min，然后在室温下13000r/min离心2min，吸取上清液转移至新的2ml离心管中，加入等体积的XP2 Buffer，涡旋。将样品转入HiBind DNA Mini Column，并放入2ml的收集管，室温10000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体，重新使用收集管，向HiBind DNA Mini Column中加入300μl Buffer XP2，室温10000r/min离心1min，倒掉液体，扔掉收集管，将HiBind DNA Mini Column放入新的2ml的收集管中。向HiBind DNA Mini Column中加700μl SPW·wash Buffer（提前用无水乙醇稀释），室温10000r